细菌视紫红质(br)基因的克隆和表达

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1、浙江大学硕士学位论文细菌视紫红质(BR)基因的克隆和表达姓名：李凌申请学位级别：硕士专业：生物物理学指导教师：吴敏;乔守怡20000601浙江大学硕士学位论文摘要f细菌视紫红质(Bacteriorhodopsin，BR)是嗜盐菌细胞膜上唯一的色素蛋白，足一个分子量为26KD的248肽的光敏蛋白。BR以视黄醛(retinal)作辅綦，在光诱导下吸收光子后会产，卜一系列的光循环中间体，最后又回到原始状态。在BR的光循环过程中发现了紫膜的光电转换过程，这种独特的光驱色变和光电响应特性使BR成为光子学研究中的理想材料。国内、外对BR的研究侧重于对其理化和光电

2、特性的研究和质子通道机理方面的理论研究，在遗传工程研究方面存在很多空白，限制了BR研究的深入。鉴于目前适用于嗜盐菌的表达载体很少，外源基因转化嗜盐菌的过程要比转化E．coll．复杂得多，过程较难控制，效率也不高，而且因为适合于转化嗜盐菌的质粒拷贝数很少，通常无法用直接抽提质粒经酶切鉴定的方法确认是否真正将外源基因导入了宿主细胞，故我l

3、’懿择E．coli．作为宿主细菌，将通过PCR技术获得的BR基因克隆入原核高效表达载体pGEX一4T．2中，用IPTG诱导表达获得BR与GST(谷胱苷肽转移酶)的融合蛋白。，由于GST的引入，方便了以后的纯化蛋白工作了

4、然后经Westernblot验证了表达蛋白的大小与预想的一致。f由于BR是一种生物分子材料，可通过化学修饰或定点突变等方法来进行改造，可以自山选择来修饰BR。如何通过定点诱变使得BR成为人类所需的材料是人们研究的摄终目的。经遗传工程改良的BR蛋白质分子，往往具有一些新的光电特性，与天然BR相比，更适于用作生物分子器件的材料。我们的研究工作为以后更广泛深入的改良BR奠定了基础。∥关键词：细菌视紫红质(BR)，视黄醛，紫膜，原核表达，融合．一．塑垩盔鲎堡主堂些丝墨——AbstractBacteriorhodopsin(BR、foundinthecellm

5、embraneofhalobacteriaisthebestunderstoodiontransportproteinandhasbecomeaparadigmformembraneproteinsingeneralandtransportersinparticular．Bacteriorhodopsinisthesimplestknownlightenergy-convertingsystems．ItissmallproteinandrequiresonlylightandalipidbilayertOgenerateanelectrochemic

6、aliongradient．TheresultingtransmembraneelectrochemicalgradientisusedbythecellforATPsynthesisandiontransport．Bacteriorhodopsincloselyresemblethevisualpigmentsofanimals，butnoobvioussequencehomologiesoriginallyindicatedanevolutionaryconnection．Bacteriorhodopsinbelongstothefamilyof

7、sevenhelixmembraneproteinswhichCarryretinalasachromophore．Bacteriorhodopsin，whichconsistsofasinglepolypeptidechainof248aminoacids．Baeteriorhodopsin(26，000)containsamoleculeofall—trans-retinalastllechromophore．whichislinkedtoLys-216asaSchiff’Sbase．Thepolypeptidechainformsacontin

8、uumofsevenahelices，eachofwhichspansthemembraneandislargelyembeddedinit．AbsorptionofaphotonbyBRinitiatesacatalyticcyclethatleadstovectorialtransportofaprotonoutofthecell．Afterabsorption，theall-trans-retinalisomerizestoa13-cisconfigurationandBRundergoesaphotocycle：BR570---’K59旷÷L

9、550斗M4lo—÷N520—÷0640_÷BRs70Inthispaper,wereportstudies