拟南芥花药特异表达的β-1,3-葡聚糖酶基因功能分析

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1、华中农业大学硕士学位论文拟南芥花药特异表达的β--1，3--葡聚糖酶基因功能分析姓名：廖晓芬申请学位级别：硕士专业：作物遗传育种指导教师：涂金星201206拟南芥花药特异表达的13—1,3一葡聚糖酶基因功能分析摘要植物的8．1，3．葡聚糖酶(E．C．3．2．1．39)是一类重要的病程相关(PR)蛋白，属于PR．2家族，负责催化水解B．1，3．葡聚糖(B．1，3链连接的葡聚糖多聚体)。B-1，3-葡聚糖酶可在病理或相关的条件下诱导产生，同时，还参与了植物体内很多生理发育过程，如细胞延长、分裂，花粉管的萌发与

2、延伸、果实的成熟、种子的萌发以及四分体后期小孢子的释放等。在甘蓝型油菜不育材料7365A和可育材料7365B中，利用SSH差减文库和反向Northem杂交，得到76个差异表达的Unigenes。根据拟南芥花药发育调控网络中提供的信息，结合Real．timePCR技术，发现BnA6和BnMSR66基因在不育材料7365A中受到了明显的抑制。BnA6和BnMSR66基因都编码B．1，3．葡聚糖酶，可能参与到花药发育中胼胝质的降解过程。为了鉴定BnA6和BnMSR66是否直接参与到花药发育过程中胼胝质的降解过程

3、，我们克隆了BnA6和BnMSR66基因在拟南芥中的同源基因(At4914080和At39237700)，同时克隆了拟南芥的另外两个B．1，3．葡聚糖酶基因(At4916260和At3924330)，将这四个基因全长ORF分别融合A9、AMS、MYBl03基因的启动子构建提前表达载体转化拟南芥。由于其中三个基因都含有一个被认为是识别B．1，3．葡聚糖的糖结合模块——-X8结构域，我们同时克隆了没有X8结构域的部分ORF，同样分别融合A9、AMS、MYBl03基因的启动子，也构建提前表达载体转化拟南芥。通过

4、对转化单株的筛选与鉴定，我们21个提前表达载体总共获得了276株阳性苗，其中不育单株52株，大部分为BnMRS66在拟南芥中的同源基因去除X8结构域的部分ORF提前表达载体转化所得。无论融合的是A9还是AMS，或者MYBl03的启动子，基本都出现了败育的表型。对败育材料的进一步细胞学观察，发现在花粉母细胞减数分裂形成小孢子的过程中，与野生型几乎没有明显的差异，但是在小孢子继续发育成为成熟花粉粒的过程出现异常，相比于野生型材料平整的小孢子外壁，不育材料的小孢子外壁粗糙不平，而且细胞内明显的液泡化，无法正常进

5、行有丝分裂依次形成双核、三核花粉粒。苯胺蓝染色结果发现，转化单株和野生型材料四分体时期，胼胝质层存在明显的差异。转化单株的整个四分体外周基本检测不到胼胝质的存在，仅在小孢子与小孢子的间隙能看到少量的胼胝质，而野生型材料，我们能够在整个四分体周围与内部都检测到很强的胼胝质信号。从而，我们可以确定，转化单株之所以出现败育是华中农业大学2012届硕士研究生学位论文因为花药发育过程中胼胝质的提前降解，而胼胝质的提前降解直接导致了小孢子无法正常发育成为可育的成熟花粉粒。GUS染色与拟南芥电子表达谱分析结果表明，目标

6、基因主要在拟南芥花序内部几朵小花(对应花药发育的9期、10期和11期)的花药里表达，较大的花蕾以及开放的花、叶片、叶鞘、茎、根等部位均没有表达。以上结果综合分析可知，花药特异表达的B．1，3．葡聚糖酶基因(At3923770)的提前表达能够引起花药发育过程中胼胝质的提前降解，从而影响小孢子进一步发育成为成熟的花粉粒，导致植株出现败育。关键词：拟南芥、B．1，3．葡聚糖酶基因、提前表达、胼胝质、雄性不育AbstractPlantD．1，3．glucanaseispathogenesis—relatedpro

7、tein，classifiedasmemberofthePR一2familyandcatalyzedthehydrolysisofB-1，3一glucan(apolymerofp-1，3-linkedglucoseresidues)．D．1，3一glucanasecanbeinducedbypathogensorotherstimuli，meanwhile，thisenzymemaybeinvolvedinvariousphysiologicalanddevelopmentalprocesses，such

8、ascellelongation，celldivision，pollengerminationandtubegrowth，fruitripening，seedgerminationanddissolutionofmicrosporesintetrads．BySSHmethodandreverseNorthemblot，76differentiallyexpressedunigeneswereidentifiedfromthep