抗猪瘟卵黄抗体的制备及喷雾干燥

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1、万方数据分类号：$852．3单位代码：学号：100862011412抗猪瘟卵黄抗体的制备及喷雾干燥Thepreparationandspray--dryingofeggyolkantibodyAgainstCSFV学位申请人：指导教师：学科专业：学位类别：授予单位：答辩日期：肖静静董世山教授基础兽医学农学硕士河北农业大学二。一四年五月二十八日万方数据独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包

2、含为获得塑兰垦盔些盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：肖督蒋签字日期：．Ⅺ14-年5月3f日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解塑兰垦盎些盘鲎有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权塑兰垦壅些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位

3、论文作者签名：岗静静导师签名：签---T-H期：卫l午年5月引日签字日期：力碎年钥弓／日学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：电话：邮编：万方数据摘要猪瘟是危害养猪业的重要疾病。特异性抗体具有较好的治疗效果，但从动物分离高免血清或制备单克隆抗体价格高、产量低，不适合大量生产；而卵黄抗体(IgY)来源广、成本低，适合大规模生产。近年来关于IgY的研究越来越多，其在疾病防治方面收到好的效果。本试验主要探讨抗猪瘟卵黄抗体的制备，卵黄抗体ELISA检测方法的建立，同时研究卵黄抗体喷雾干燥工艺及其保护剂。方法：1．抗猪瘟卵黄抗体EL

4、ISA检测方法的建立(1)采用猪瘟疫苗病毒包被酶标板，经氯仿提取的阴、阳性卵黄抗体作为一抗，用方阵滴定法进行抗原最佳包被浓度、酶标二抗工作浓度的确定；比较P／N值，确定各步孵育时间。(2)选取未免疫猪瘟疫苗的鸡蛋30枚，氯仿法提取抗体，测其OD值，依据统计学方法计算阴阳临界值；用己知效价的卵黄抗体经IHA和己建立的ELISA方法进行对比试验，比较两种方法的敏感性；选取禽流感、新城疫、猪腹泻二联苗阳性卵黄抗体，同时以猪瘟阳性与阴性血清抗体作为对照，检测ELISA方法的特异性；检测建立的ELISA方法的重复性。2．猪瘟卵黄抗体的制备

5、及品质检测(1)选取200日龄健康海兰灰蛋鸡50只，用灭活猪瘟疫苗胸部肌肉分点注射，取免疫后不同天数的鸡蛋提取卵黄抗体。用已建立的ELISA方法进行检测，当效价下降到一半时，进行下一次免疫。收集效价达到l：4096的鸡蛋，用水稀释法提取卵黄抗体。(2)将提取的卵黄抗体接种普通营养琼脂和厌氧肉汤培养基中，37。C培养24h，观察细菌生长情况。动物安全性试验，将提取的卵黄抗体给小鼠和雏鸡注射，观察动物精神状态，72h后剖检，观察心、肝、脾、肺、肾等器官有无病理变化。3．喷雾干燥保护剂的筛选及工艺研究用葡萄糖、蔗糖、脱脂乳、乳糖、海藻

6、糖分别做抗体保护剂，将提取的卵黄抗体进行喷雾干燥。观察上述物质的浓度变化对抗体活性的保留水平的保护作用，对比五种糖在高温下对抗体的保护水平。筛选最佳保护剂及保护浓度。设计入口温度、进料速度、糖浓度的3因素3水平正交试验，分析3因素对抗体活性及出粉率两个指标的影响水平，选取最佳喷雾工艺。试验结果如下：1．(1)抗原最佳包被浓度为1：1000，酶标二抗工作浓度为1：6000，一抗稀释至1：1024时，阳性值在1．000左右，且相邻孔的OD值变化较大。其所对应的阴性值小于0．2，且P／N值最大。实验条件的优化结果：2％的明胶37℃封闭

7、30min，一抗和二抗最佳孵育条件分别为37℃lh和45min，最佳显色时间为室温20min，OD450nm值接近l，且P／N值较大。(2)经计算，30份猪瘟阴性卵黄抗体平均值(X)为：0．103，标准差(SD)为O．014。根据统计学分析，OD450nm值20．145时，判定为阳性；OD450nm值<0．131时，判定为阴性；OD450nm值介于两者之间为可疑。万方数据猪瘟阳性卵黄抗体经IHA检测效价为27。将此卵黄抗体用建立的间接ELISA方法检测，抗体倍比稀释至2H后，仍能检测出阳性，表明建立的ELISA方法具有很高的灵敏

8、性。HI效价分别为26、29的H9亚型禽流感和新城疫的阳性卵黄抗体及猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联苗的阳性卵黄抗体，同阴性猪瘟血清抗体检测结果一致，其值均小于0．131，而阳性猪瘟血清抗体值为1．112，表明该方法特异性较强。5份卵黄抗体分别经同一批次制备的酶