副猪嗜血杆菌的分离鉴定及诊断方法与灭活疫苗的研究

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1、华中农业大学学位论文独创性卢明及使用授权书学位论文龟如需保密，解密时间年月日是否保密独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果．尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定．与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意．研究生签名：蓉地辽王时闻：蹦年j月弓口日学位论文使用授权书本入完全了解“华中农业大学关于保存，使用学位论文的规定”，即学生必须按照学校要

2、求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版，并提供目录捡索和阅览服务，可以采用影印。缩印或扫描等复制手段保存．汇编学位论文．本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表，传播学位论文的全部或部分内容．注：保密学位论文在解密后适用于本授权书．学位论文作者戳黜旺导眺：牌彦签名日期：五旧6年j月．扣日签名日期：∥卜“年r月弓／日注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间静J猪嗜缸杆菌的分离鉴定及灭活疫苗的研究摘要副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis，HPS)引起猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎；“随着世界养猪业的发

3、展，该病已成为全球范围内影响养猪业的一种重要细菌性疾病。我国足一个养猪大国，但日自口仍没有对副猪嗜血杆菌进行系统研究的报道。本研究对副猪嗜血杆菌的病原学、流行病学、诊断方法和灭活疫苗进行研究，为我国副猪嗜血杆菌病的基础研究以及我国对于该病的诊断、预防与控制奠定基础，主要研究内容如下：1．副猪嗜血杆菌的分离鉴定及关于我国的病原学调查从全国十五个省市送本室检测的疑似患多发浆膜炎，关节炎和脑膜炎的病料中分离到281株细菌，通过细菌形态，培养特性、生化特性及PCR鉴定最终确定为副猪嗜血杆菌。对从2003年6月到2004年12月送我室检测的828例病料进行细菌分离鉴定，结

4、果有183例分离出副猪嗜血杆菌，分离率高达22．1％，表明该菌在我国广泛流行。对本室分离的所有副猪嗜血杆菌按琼脂扩散试验和间接血凝试验血清学分型方法进行血清型鉴定，结果表明我国以血清4型(24．2％)和5型(19．2％)最为流行，其次为13型(12．5％)、14型(7．1％)和12型(6．8％)，另外有12．1％的分离菌株不能进行血清学分型。该结果为我国对丁二副猪嗜血杆菌病的预防与控制提供了参考依据。2．副猪嗜血杆菌生物学特性的研究以本室分离鉴定的副猪嗜血杆菌MD0322株和SH0165株为代表菌株对该菌的各种生物学特性进行研究。对不同固体培养基的比较发现该菌在

5、TSA固体培养基和n彤SN固体培养基上生长最好，对不同液体培养基的比较发现该菌在TSB液体培养基、TMB液体培养基和BHI液体培养基中生长最好。副猪嗜血杆菌在TSB液体培养基中的生长曲线显示培养16～18h活菌数达到最高峰，随后大幅下降。副猪嗜血杆菌在生理盐水、磷酸盐缓冲液和TSB液体培基中4"C保存的存活曲线显示该菌在以上介质中每保存一天时间其活菌数均要下降一个对数值左右，说明副猪嗜血杆菌通常不能采用单纯的平板菌落计数法活菌计数．本研究提出的分光光度计测定法合理地解决了副猪嗜血杆菌即时计数的问题，为该菌各种动物实验的开展奠定了基础。3．副猪嗜血杆菌抗体间接血凝

6、试验检测方法的建立及我国血清学调查将副猪嗜血杆菌经超声波破碎处理后的产物致敏醛化鞣酸化红细胞，建立间接血凝试验用于检测副猪嗜血杆菌抗体。采用该法对副猪嗜血杆菌15种血清型标准血清的检测结果都为阳性；对猪瘟、口蹄疫、圆环病毒、细小病毒、猪伪狂犬、猪繁殖与呼吸综合征、猪气喘病，猪链球菌、猪肺疫巴氏杆菌、猪传染性萎缩性鼻炎及胸膜肺炎等病原的标准阳性血清的检测结果全为阴性，具有良好的特异性。本检测毕中农业大学博士学位论文方法最低可检测出l：2¨倍稀释的高免血清，具有良好的敏感性。按本方法制备的间接血凝诊断试剂保存期可达6个月。本研究为副猪嗜血杆菌抗体的检测提供了一种简捷

7、、灵敏和特异的方法。采用该间接血凝试验检测方法从2005年3月到2005年12月对全国七个省份芡血清1665份的抽检结果阳性784份，阴性881份，阳性率47．1％，从抗体方面表明副猪嗜血杆菌病在我国各地流行较普遍。4．副猪嗜血杆菌病灭活疫苗的研究4．1副猪嗜血杆菌病灭活疫苗制备与检验用菌株的筛选根据本室完成的副猪嗜血杆菌流行病学调查结果，以我国最流行的血清4型和5型菌株研制疫苗，通过对临床资料及动物试验结果的比较筛选出毒力较强，免疫原性较好的菌株即血清4型MD0322抹和血清5型SH0165株作为疫苗候选菌株，毒力稳定性和免疫原性稳定性试验结果表明两株菌种连传

8、25代后仍保持稳定，因而