鲫鱼乙酰胆碱酯酶对有机磷农药敏感性及有机磷农药残留研究

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1、华中农业大学博士学位论文鲫鱼乙酰胆碱酯酶对有机磷农药敏感性及有机磷农药残留研究姓名：刘晓宇申请学位级别：博士专业：农产品加工及贮藏工程指导教师：吴谋成20080620鲫鱼乙酰胆碱酯酶列有机磷农药敏感性及有机磷农药残留研究摘要乙酰胆碱酯酶(AcetylCholinesterase，ACHE)是一种多分子型糖蛋白，存在于生物体内神经组织、肝脏、肌肉、红细胞以及脾脏中，在生物神经传导中起重要作用，其活性受有机磷和氨基甲酸酯类农药特异性抑制，AChE的活性变化是敏感的农药毒理学指标，可被应用于农药的毒性和环境污染评价的生物

2、标记物。因而关于AChE的研究成为环境、农药、毒理领域的研究热点。鱼类是水生生态系统中对有机磷农药(OrganophosphoruspesticidesOPs)较敏感的一类动物，而关于淡水鱼类乙酰胆碱酯酶的研究鲜见报道。本文首次以淡水鱼类鲫鱼为对象，提取其脑、肝脏、肌肉中的AChE并进行分离纯化，对其生化性质进行了研究。进而以六种有机磷农药为抑制剂，探讨和评价了鲫鱼AChE对有机磷农药的敏感性。建立了两种有机磷农药敌敌畏和辛硫磷的化学发光快速分析方法；建立了鲫鱼中辛硫磷残留量的高效液相色谱分析法。研究结论如下：1．

3、以鲫鱼、兔、鸡为AChE酶源，测定并比较了三种动物以及同一动物的不同部位的蛋白质含量，AChE酶活及对有机磷农药敌敌畏的敏感性指标ICso。研究结果为：七种酶源中，鲫鱼脑AChE比酶活最高，达105．599m01／min．g，而其IC50值仅为8．16899／mL，为所筛选酶源中的最低值。故确定鲫鱼为AChE酶源。，2．首次运用正交实验法探讨了鲫鱼脑、肝脏、肌肉中AChE的提取条件的优化组合。研究结论为：鲫鱼脑、肝脏和肌肉乙酰胆碱酯酶的最佳提取条件为，提取液为pH值为8．0的磷酸盐缓冲溶液、匀浆比为1：4。在此条件

4、下鲫鱼脑、肝脏和肌肉中AChE的比酶活最高，比酶活力值最大。其AChE比酶活分别为1499mol／min．g，139m01／min．g和2629mol／min．g。3．运用中心组合实验和响应面分析法得鲫鱼脑、肝、肌肉AChE比酶活测定最佳条件组合为，鱼脑酶活测定的最佳条件为保温时间35rain，保温温度32℃，pH值7．6。肝脏酶活测定的最佳条件为保温时间28rain，保温温度30℃，pH值7．6。肌肉酶活测定的最佳条件为保温时间31min，保温温度31℃，pH值7．6。4．鲫鱼脑、肝、肌肉AChE的生化性质参数及

5、对六种有机磷农药的敏感性评价指标结果如下：华中农业大学2008届博士学位论文4．1鲫鱼脑部、肝脏、肌肉中AChE粗提取液的米氏常数Km值分别为1．063mmol／L，7．864mmol／L，4．028mmol／L；最大反应速度V嗍值分别为52．91mmoY(L．min)，31．746mmoY(L．min)，135．13mmoY(L．min)；测得K瓶值可知：在有机磷农药敌敌畏抑制条件下，鲫鱼脑部乙酰胆碱酯酶与底物亲和力最强，其次是肌肉，肝脏中乙酰胆碱酯酶与底物亲和力最弱。4．2鲫鱼脑部、肝脏、肌肉中AChE粗提取液

6、对有机磷农药敌敌畏的双分子速率常数Ki值分别为1．011L／(g．min)，0．472L／(g．min)，O．173L／(g．min)。由测得K值可知：对于有机磷农药敌敌畏的抑制，鲫鱼脑部乙酰胆碱酯酶的敏感性最强，其次是肝脏，肌肉中乙酰胆碱酯酶的敏感性最弱。4．3通过测定鲫鱼脑部、肝脏、肌肉中AChE粗酶液对六种有机磷农药的IC50值，分析比较可得以下结论：鲫鱼脑部AChE粗酶液对六种有机磷农药的敏感性由强到弱分别为：敌敌畏>辛硫磷>杀螟松>三唑磷>乐果>倍硫磷。鲫鱼肝脏AChE粗酶液对六种有机磷农药的敏感性由强到

7、弱分别为：敌敌畏>辛硫磷>杀螟松>乐果>倍硫磷>三唑磷。鲫鱼肌肉AChE粗酶液对六种有机磷农药的敏感性由强到弱分别为：敌敌畏>三唑磷>辛硫磷>杀螟松>乐果>倍硫磷。4．4六种有机磷农药和胆碱酯酶强抑制剂毒扁豆碱对乙酰胆碱酯酶的抑制效应比较结果为：鲫鱼各部分AChE对敌敌畏和毒扁豆碱表示出较强的敏感性，抑制曲线随时间呈良好的上升趋势，而其中肝脏的酶构成种类复杂，例如有超氧化物歧化酶(SOD)等，干扰较大，使趋势曲线杂乱。5．对鲫鱼脑和肝脏AChE进行了纯化和初步结构表征。结果表明，鲫鱼肝脏AChE粗酶液经聚乙二醇双水

8、相萃取，DEAE．SephadexA．50离子交换柱层析后纯化后，纯化倍数达145倍。鲫鱼脑AChE粗酶液经聚乙二醇双水相萃取，DEAE．SephadexA-50离子交换柱层析和SephadexG-200纯化后得到了较纯的乙酰胆碱酯酶(AChE)，纯化倍数达214倍。经紫外吸收光谱、红外光谱和圆二色谱分析证明，鲫鱼脑AChE纯化最终产物具有蛋白质和酶的相关结