嗅鞘细胞的培养和脂质体介导的转染的实验研究

《嗅鞘细胞的培养和脂质体介导的转染的实验研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、温州医学院硕士学位论文嗅鞘细胞的培养和脂质体介导的转染的实验研究姓名：徐朝伟申请学位级别：硕士专业：神经病学指导教师：张旭2012-05-16温州医学院硕士学位论文嗅鞘细胞的培养和脂质体介导的转染的实验研究中文摘要目的：培养出较高纯度和活力的嗅鞘细胞(OlfactoryEnsheathingCells，OECs)，按照脂质体转染试剂(Lipofectamine俐2000)建议的步骤和要求对OECs进行转染：(1)对获取的OECs进行鉴定及纯度分析；(2)探讨Lipofectamine7“2000介导pEGFP-N

2、1转染OECs的条件和效率，分析转染过程对OECs的活力的影响。方法：(1)获取Sparague-Dawley(SD)雌性大鼠嗅球的外两层组织，剪切消化获取细胞悬液，将细胞悬液平均分成三份，培养于含5％C02的37℃恒温培养箱中。A组采用6h、24h两次差速贴壁纯化细胞，B组采用6h、24h两次差速贴壁+胰酶限时消化法纯化细胞(1imiteddigesti．ontimeofpancreaticenzyme)，C组采用Nash法纯化细胞。三组都采用NGFRP75与PI双染的方法对培养的OECs进行鉴定，并分析三种不

3、同方法获取的OECs的纯度。(2)选择以上效率最高的细胞培养及纯化方案，培养出较高纯度和活力的OECs用于转染。转染前24h将OECs重悬，以每孔约105个细胞培养于含PLL包被载玻片的24孔培养板，使细胞融合度达到80％左右，然后分别采用不同的脂质体和质粒浓度，按照LipofectamineⅧ2000的转染步骤，将真核表达载体pEGFP—N1转染入OECs。转染后48h，在激光共聚焦显微镜下，每张盖玻片随机选取10个非重复视野，计算出其中的总细胞个数和散发绿色荧光的细胞个数。OECs的转染率=(表达绿色荧光的细

4、胞个数／观察到的细胞总个数)×100％。然后，根据各组的转染率情况分析脂质体和质粒各自最佳的转染剂量。(3)选用MTT方法{3一(4，5一二甲基噻唑一2)一2，5一二苯基四氮唑溴盐)对转染后的OECs的活力进行检测，分析Lipofectamine侧2000介导的细胞转染过程对OECs活力的影响。于酶联免疫检测仪上测定各孔在490nm波长的吸光值，细胞的活力与吸光度呈正比。结果：(1)OECs的形态学分析：各组细胞培养3天左右均可见OECs贴壁生长，OECs折光性较好，胞体较小，突起细长，多数呈双极和三极形态，少数

5、呈单极和多极形态。各组中均可见胞体大，折光性差的成纤维细胞生长。随着培养时间的延长，OECs出现成簇生长的趋势，细胞密度进一步增加，突起变得更加细长并交织成网状，当培养到11天左右，细胞长满瓶底。(2)OECs的鉴定：激光共聚焦显微镜下观察免疫染色的OECs，其中细胞核发红温州医学院硕士学位论文色荧光、细胞膜散发绿色荧光的即为OECs。(3)OECs的纯度分析：A组、B组和C组获得的OECs纯度分别是(67．3±6．2)％、(83．7±7．7)％和(74．6±9．5)％，各组间比较有统计学差异(仁13．633，P

6、0．05)。因此，在以下的细胞转染实验中，我们采用了B组方案，即采用6h、24h两次差速贴壁+胰酶限时消化培养和纯化OECs。(4)脂质体介导pEGFP—N1转染OECs的效率：本实验采用24孔板进行转染，当Lipofectaminel”2000的剂量2．0Ill／孔，pEGFP—N1的剂量1．2ug／孔时，OECs的转染效率最高，其转染率为14．8％。(5)转染过程对OECs活力的影响：转染效率最

7、高组和未转染组的细胞活力进行比较，转染后的前2’5天，转染组细胞活力明显较差，此时两组比较有显著差异(尸<0．05)，但随着培养时间的延长，转染组细胞的活力逐渐恢复，第6天以后两者活力无显著差异(尸>0．05)。结论：(1)在本实验中，我们采用6h、24h两次差速贴壁+胰酶限时消化法培养出了较高纯度的OECs，为进一步研究OECs的生物学功能奠定了基础。(2)在该实验中，我们采用了脂质体介导的细胞转染技术成功的将真核表达载体pEGFP-N1转染入OECs，该载体在OECs内表达良好。(3)脂质体Lipofecta

8、mine删2000介导的细胞转染过程对OECs有明显的毒性，导致细胞活力下降，但随着培养时间的延长，OECs的活力能够恢复。关键词：嗅鞘细胞；差速贴壁；胰酶限时消化：pEGFP—N1；脂质体温州医学院硕士学位论文TheCultureofOlfactoryEnsheathingCellsandTransfectionmediatedbyLiposomeAbstractObj