甜菜m14品系bvm14-sams2基因的克隆及盐、氧化胁迫下的应答

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1、分类号⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯UDC密级⋯公⋯-开⋯⋯Z秀庐夕擎硕士研究生学位论文甜菜M14品系BvMl4-SAMS2基因的克隆及盐、氧化胁迫下的应答申请人：学号：培养单位：学科专业：研究方向：指导教师：完成日期：谷丹2111243生命科学学院生物化学与分子生物学植物生物技术与基因工程李海英教授2014年3月25日中文摘要甜菜M14品系富含丰富的优质基因资源，对盐、寒冷、干旱等非生物胁迫具有极强的耐受性，是研究逆境胁迫极为难得的材料。课题组前期以甜菜M14品系为试验材料，在500mMNaCI胁迫下，利用蛋白质组学技术，从蛋白质水平筛选

2、获得了75个差异蛋白质点；利用SSH技术，在转录水平筛选获得了58个Unigenes序列，二者匹配得到了蛋白质点——BvMl4．SAMS2。本试验以上述蛋白质点为基础，采用RACE技术，克隆获得甜菜M14品系BvMl4一SAMS2基因cDNA全长1538bp，包含最大开放阅读框ORF1l82bp，编码393个氨基酸。亚细胞定位预测该蛋白存在于细胞质基质中。同源序列分析发现，与拟南芥(Arabidopsisthaliana)AtSAMS氨基酸序列捌以性达到了98％。采用实时荧光定量(Real．TimePCR)技术对甜菜M14品

3、系BvMl4一剐膨蛇基因进行表达模式分析，结果表明，在正常生长条件下，BvMl4．SAMS2基因在甜菜M14品系根、茎、叶、花中的表达量大小依次为：根>叶>花>茎，其中，BvMl4一SAMS基因在根中的表达量比叶片中高出4．26倍。对甜菜M14品系进行不同盐浓度的胁迫处理后，分别以0mMNaCI胁迫下的根和叶片为对照，对胁追后甜菜M14品系叶片和根中的BvMl4-SAMS2基因进行表达量的比较分析，发现，随着盐浓度的增加，BvMl4．SAMS2基因在叶片中的表达量逐渐增加，在盐浓度达到500mM时，表达量增加了49％。而根中

4、，随着盐浓度的增加，BvMl4一SAMS2基因的表达量无明显变化。结果表明，受盐胁迫诱导，BvMl4一SAMS2基因在甜菜M14品系叶片中的表达量随着盐浓度的增大而增大，根中的表达量随着盐浓度的增大无明显变化。本试验对甜菜M14品系BvMl4一SA雠因进行了原核表达体系的研究，构建了原核表达载体pET28a．BvMl4．SAMS2，并将构建好的重组载体转化至原核表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)中，经Western印迹鉴定，结果表明，BvMl4．SAMS2蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达，测定BvM14-SAMS2

5、蛋白浓度为73。57pg／ml，BvMl4一SAMS2蛋白酶活力为1。24U／mg。本试验对转BvMl4一SAMS2基因拟南芥在胁迫下的应答进行了研究，构建了植物表达载体pCAMBlAl305．1一BvMl4．SAMS2，并转化农杆菌EHAl05。利用花序侵染法分别获得了拟南芥SAMS基因过表达植株(OX)和拟南芥SAMS黑龙江大学硕士学位论文基因敲除恢复型植株(CO)的Tl代阳性转基因植株。以拟南芥野生型植株(WT)和SAMS基因敲除植株(KO)为对照，分别测定SAMS基因过量表达植株(OX)和SAMS基因敲除恢复植株(C

6、O)的T1代阳性转基因植株在盐、氧化胁迫下的鲜重、根长、叶绿素、脯氨酸、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性、过氧化氢酶(CAT)酶活，以及SAMS酶活等指标。结果表明，转入BvMl4-SAMS2基因的SAMS基因过表达植株(OX)和SAMS基因敲除恢复植株(CO)对盐、氧化胁迫具有更强的耐受性，表明，甜菜M14品系BvMl4-SAMS2基因具有提高植物抵御盐、氧化胁迫的能力。关键词：甜菜M14品系；BvMl4一SAMS2基因：盐、氧化胁迫Abstract．AbstractSugarBee

7、tM14lineisrichingeneresourcesforhighqualitytraits，andalsopossessstrongtolerancetoabioticstresses，includingsalt，coldstressanddroughtstress．TheSugarBeetM14lineisanuncommonmaterialthatcangrowanddevelopwellunderthebioticandabioticstresses．UsingtheSugarBeetM14lineasthee

8、xperimentmaterial，atotalof75differentiallyexpressedproteinspointsunder500mMNaCistresshavebeenobtainedbyusingproteomicstechnology．Inaddition，58uni