靶向bcl-xl脱氧核酶肿瘤化疗增敏实验研究

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1、万方数据中图分类号p岫j．1一UDCbl旦硕士学位论文学校代码!Q墨三三密级公开靶向Bcl．xL脱氧核酶肿瘤化疗增敏实验研究ChemosensitizationofSolidTumorsbyInhibitionofBcl-·xLExpressionUsingDNAzyme作者姓名：学科专业：研究方向：学院(系、所)：指导教师：于晓晖基础医学病理学与病理生理学湘雅医院孙仑泉教授答辩委员会主席中南大学二0一四年五月万方数据学位论文原创性声明本人郑重声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我

2、所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。作者签名：辱既哩日期：型生年立月立厶日学位论文版权使用授权书本学位论文作者和指导教师完全了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版；本人允许本学位论文被查阅和借阅；学校可以将本学位论文的全

3、部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其它手段保存和汇编本学位论文。保密论文待解密后适应本声明。作者签名：辱阻嗥日期：塑坐年—L月型日导师签名日期：丝年j．-月—堡日万方数据本课题受到以下基金资助：◇国家自然科学基金项目“靶向Bcl—xL脱氧核酶的肿瘤化疗增敏实验研究¨(面上项目，批准号：81172188)◇国家自然科学基金项目“通过模式识别受体诱导的炎症反应及其在鼻咽癌发生发展中的机制研究”(重大研究计划，批准号：91129709)令国家高等学校博士点学科专项基金“Bcl．xL在鼻咽癌化疗抵抗中的作

4、用及靶向Bcl．xL脱氧核酶的致敏研究’’(批准号：20101101621010)万方数据硕士学位论文中文摘要靶向Bel．xL脱氧核酶肿瘤化疗增敏实验研究中文摘要化疗作为肿瘤治疗的重要手段之一，虽然使许多肿瘤患者获益，但疗效仍难以让人满意。肿瘤细胞的原发性和获得性耐药是导致肿瘤化疗失败的主要原因。研究表明，Bcl．xL的高表达与肿瘤细胞化疗抵抗呈极强的正相关。脱氧核酶作为一种新型的基因治疗工具，在一定条件下切割mRNA分子中配对嘧啶和未配对嘌呤之间的磷酸二酯键，抑制基因转录和翻译，调控目标蛋白的表达。本课题针对Bcl．

5、xLmRNA，设计合成一种具有高效抑制性及特异性的“1O一23”型脱氧核酶DT882，在不同肿瘤细胞系中证明其能够抑制Bcl—xL表达和逆转肿瘤化疗抗性细胞对化疗药物的抵抗性，通过人前列腺癌移植瘤模型体内研究其化疗增敏活性。研究表明，靶向Bcl—xL脱氧核酶具有显著的抑制肿瘤生长和化疗增敏效应，是一种有效的化疗增敏剂，在癌症药物治疗中具有潜在的应用价值。第一部分目的：靶向Bcl．xL脱氧核酶的设计、筛选和生化分析。方法：利用生物信息学获得81个Bcl．xLmRNA可切割位点，针对每个位点进行杂交自由能分析，得到26个潜

6、在的靶位点。依据筛选出的靶位点，按“lO．23”型设计脱氧核酶，进行1+1，3+3，5+5硫代修饰，分析三种修饰脱氧核酶在血清中的稳定性。单循环反应，以Kobs为参数，对三种硫代修饰脱氧核酶进行动力学分析。运用体外切割反应筛选具有切割活性的脱氧核酶。结果：1+1，3+3，5+5三种硫代修饰脱氧核酶在血清的稳定性分析发现，脱氧核酶稳定性随着被修饰碱基数增加而增加，而其切割万方数据硕士学位论文中文摘要效率却随着碱基数的增加呈下降趋势。综合分析我们采用3+3硫代修饰方式。运用体外切割反应筛选出10个具有Bcl．xLmRNA切

7、割活性的脱氧核酶。结论：体外成功筛选出10个具有Bcl．xLmRNA切割活性的脱氧核酶，为后期脱氧核酶细胞内生物活性筛选提供实验基础。第二部分目的：分析Bcl．xL脱氧核酶对靶基因的抑制作用。方法：以TMP为转染试剂将初次筛选出的10种脱氧核酶转染至PC3细胞，免疫印迹检测各种脱氧核酶的生物学活性，筛选出对Bcl—xL抑制效果最显著的脱氧核酶。将筛选出的Bcl．xL脱氧核酶经TMP转染至不同肿瘤细胞株(前列腺癌细胞PC3、膀胱癌细胞T24、非小细胞肺癌细胞A549以及鼻咽癌细胞CNEl)，免疫印迹验证其在不同肿瘤细胞中

8、的生物活性。结果：免疫印迹检测发现转染脱氧核酶DT882、DT883、DT884组与转染试剂组相比Bcl．xL蛋白表达水平显著下降(P