《莫媛媛论文》doc版

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1、分类号密级UDC编号硕士研究生学位论文题目寡孢节丛孢粘性相关蛋白AMad1和PA14的功能初步研究学院（所、中心）云南省生物资源保护与利用重点实验室—省部共建国家重点实验室培育基地专业名称微生物学研究生姓名莫媛媛学号1200901499导师姓名张克勤职称教授杨金奎职称副研究员梁连铭职称助理研究员二0一二年五月独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人或集体已经发表或撰写过的研究成果，对本文的研究做出贡献的集体和个人均已在论文中作了明确的说明并表示

2、了谢意。研究生签名：日期：论文使用和授权说明本人完全了解云南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文和论文电子版；允许论文被查阅或借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。（保密的论文在解密后应遵循此规定）研究生签名：导师签名：日期：…………………………………………………………………本人及导师同意将学位论文提交至清华大学“中国学术期刊（光盘版）电子杂志社”进行电子和网络出版，并编入CNKI系列数据库，传播本学位论文的全部或部分内容，同意按《中国优秀博硕士学

3、位论文全文数据库出版章程》规定享受相关权益。研究生签名：导师签名：日期：云南大学二零一二届硕士学位论文寡孢节丛孢粘性相关蛋白AMad1和PA14的功能初步研究研究生：莫媛媛导师：张克勤教授杨金奎副研究员梁连铭助理研究员专业：微生物学方向：真菌分子生物学资助项目1）国家自然科学基金面上项目：过氧化物酶体蛋白在寡孢节丛孢捕食器官形成和侵染过程中的功能研究（30960229）云南大学硕士毕业论文摘要寡孢节丛孢（Arthrobotrysoligospora）是研究捕食线虫真菌和线虫相互作用的模式菌株，它通过产生具有粘性的捕食器官三维菌网捕食线虫。

4、本研究以该菌株为出发菌株，对三维菌网形成过程中表达量上调的两个粘性蛋白AMad1和PA14进行了氨基酸序列和核苷酸序列的分析。同时，通过同源重组技术对这两个粘性相关蛋白的编码基因进行了敲除，并比较了突变菌株和野生菌株在生理、生化性质和侵染能力方面的差异。本文的研究结果为深入研究寡孢节丛孢粘性蛋白AMad1和PA14的功能及相关的作用机制奠定基础。主要研究结果为：1．寡孢节丛孢粘性蛋白AMad1和PA14编码基因和氨基酸序列分析寡孢节丛孢基因AOL_s000076g567编码的蛋白与金龟子绿僵菌的粘性蛋白MAD1相似性达31.2%，命名为寡

5、孢节丛孢Mad1（AMad1）。AMad1基因含有一个长度为60bp的内含子序列，编码718个氨基酸，AMad1蛋白的理论分子量和等电点分别为75.7kDa和4.33。通过功能结构域预测，发现AMad1具有粘性蛋白的重要特征：即具有6个串联重复序列、N末端带有疏水氨基酸残基的信号肽、苏氨酸丰富区、脯氨酸丰富区和糖基磷酸肌醇化（glycosylphosphatidylinositol，GPI）位点。此外分析发现AMad1含CFEM（commoninseveralfungalextracellularmembrane）结构域，研究认为在致病菌

6、中，含CFEM结构域的蛋白除了作为膜蛋白/细胞壁蛋白结构组分外，还与致病性密切相关。寡孢节丛孢基因AOL_s00007g5含有2个长度为分别为74和115bp的内含子序列，编码337个氨基酸，蛋白的理论分子量和等电点分别为36kDa和4.57。BLASTp分析发现，该蛋白具有保护性抗原结构域（protectiveantigendomain，PA14domain），命名为寡孢节丛孢PA14。PA14结构域存在于糖苷酶，糖基转移酶，蛋白酶，粘性蛋白和细菌毒素等蛋白中，赋予蛋白具有粘附功能。因2.寡孢节丛孢粘性蛋白AMad1和PA14编码基因的

7、敲除研究采用同源重组的方法，成功构建了ΔAMad1菌株和ΔPA14菌株，并对两个突变菌株和野生菌株的菌丝、菌落形态、侵染线虫能力和捕食器官超微结构进行了比较。结果发现ΔAMad1和ΔPA14菌株在菌丝、菌落形态上与野生菌株相比viii云南大学硕士毕业论文没有发生明显变化，但ΔAMad1菌株产生捕食器官数量多于野生菌株，同时ΔAMad1菌株对线虫的捕杀率升高。ΔPA14菌株产捕食器官数量与野生菌株差异不明显，但其对线虫的捕杀率却有所下降。3.粘性蛋白AMad1的间接免疫荧光定位利用合成多肽制备的AMad1蛋白抗体及异硫氰酸荧光素标记的山羊抗

8、兔IgG抗体对AMad1进行了间接免疫荧光定位实验，结果发现AMad1蛋白位于寡孢节丛孢的普通营养菌丝和三维菌网的表面。荧光显微镜下观察到三维菌网上产生的荧光比普通营养菌丝要强，推测AMad1