恶性疟原虫裂殖子表膜蛋白mspdbl1和mspdbl2的表达和分析

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1、万方数据苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。论文作者签名：丝￡望兰叁日期：丝Ⅳ：p万方数据苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有权

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3、成系统表达具有生物活性的恶性疟原虫裂殖子表膜蛋白MSPDBLl和MSPDBL2。方法：恶性疟原虫实验室培养标准株3D7提取的基因组DNA为模板，采用In．Fusion克隆技术快速连接目的片段和质粒载体pEU．His。转化大肠杆菌DH5a株，获得含有目的基因的表达质粒。通过双酶切和DNA测序分析鉴定重组质粒。中提重组质粒后，用麦胚无细胞蛋白合成系统进行表达，对表达产物进行纯化和分析。结果：PCR成功扩增6个目的基因片段，MSPDBLl(2043bp)，MSPDBL2(2200bp)，DBLl(933bp)，DBL2(921bp)，SPAMl(465bp)，SAPM

4、2(576bp)，并成功构建了6个用于麦胚无细胞蛋白合成系统的重组质粒，该6个重组质粒在麦胚无细胞蛋白合成系统中成功地表达出了6个重组恶性疟原虫蛋白rMSPDBLl(朋Ⅳ4kDa)，rMSPDBL2(朋侣4kDa)，rDBLl(朋04kDa)，rDBL2(朋04kDa)，rSPAMl(尬17kDa)，rSAPM2(Mr21kDa)，经westernblotting鉴定，表达产物的可溶性为100％，并成功纯化出重组蛋rSPAMl。结论：麦胚无细胞蛋白合成系统可以提高重组蛋白的可溶性。关于麦胚无细胞蛋白合成系统表达的重组蛋白质的纯化问题，需要进一步的研究。关键词：恶

5、性疟原虫；裂殖子表膜蛋白；麦胚无细胞蛋白合成系统第二部分恶性疟原虫裂殖子表膜蛋白MSPDBL2．DBL2结构域的原核表达和抗原性分析目的：克隆、表达恶性疟原虫疫苗候选分子裂殖子表膜蛋白MSPDBL2万方数据中文摘要恶性疟原虫裂殖子表膜蛋白MSPDBLI和MSPDBL2的表达和分析(PFl00355)的DBL2结构域，并研究其抗原性。方法：提取恶性疟原虫实验室培养标准株3D7的基因组DNA为模板进行PCR扩增，采用In．Fusion克隆技术快速连接目的片段和质粒载体，构建重组表达质粒pET28a-DBL2，转化大肠埃希菌BL21(DE3)，异丙基．p．D．硫代半乳

6、糖苷(IPTG)诱导表达并经亲和层析获得纯化的重组蛋白rDBL2。分别以恶性疟病人血清、正常人血清、对照混合血清作为一抗，蛋白质印迹(westernblotting)分析该重组蛋白的抗原性。结果：PCR扩增获得长约950bp片段，菌落PCR和测序结果显示，重组质粒pET28a．DBL2构建成功，十二烷基硫酸钠．聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS．PAGE)结果显示，经IPTG诱导并经亲和层析纯化后获得相对分子质量(尬)约为34kDa的包涵体蛋白。经变性条件纯化得到rDBL2，westernblotting分析结果显示，该重组表达蛋白rDBL2被恶性疟病人血清识别，有较好

7、的抗原性。结论：成功克隆和表达纯化了恶性疟原虫裂殖子表膜蛋白MSPDBL2的DBL2结构域，重组蛋白rDBL2有良好的抗原性。关键词：恶性疟原虫；裂殖子；原核表达；抗原性第三部分中缅边境恶性疟原虫Pfmspdbl2基因多态性分析目的：探讨中缅边境恶性疟原虫Pfmspdbl2基因多态性特点。方法：中缅边境恶性疟病人血滤纸片提取恶性疟原虫基因组DNA，根据恶性疟原虫基因Pfmspdbl2(PFl00355)为目的扩增片段设计特异性引物，进行聚合酶链反应(PCR)扩增，以恶性疟原虫标准株3D7作为参照，利对所获得的基因序列进行测序分析，评估序列多态性。结果：80份恶性

8、疟原虫基因组DNA，PC