单分子流式检测仪的研制

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1、第一章绪论1．1引言单分子检钡,O(singlemoleculedetection，SMD)就是获得单个分子的信息，达到物质检测的极限，这是物质含量检测技术中的最后一个里程碑【l】。传统的化学实验都是以分子的聚集体为目标，得到的是物质的平均性质，而平均性质往往掩盖了许多特殊的重要信息，因此只有在单分子水平上进行实验，才能得到一个分子的性质分布，研究复杂体系中的个体。SMD既可以检测非均匀聚集体中的单个分子，对它们进行识别、分类、定量描述，又可以对化学反应的途径进行实时监测，特别是能在生理条件下对生物大分子进行探测并提供分子结构和功能之间的信息，它对于推动细胞生物学、医学的

2、研究和发展以及某些疾病的早期诊断具有重要的理论和实际意义【2，31。1．2单分子检测技术目前用于单分子研究的技术很多，包括观察其构象的变化、功能活动以及与其它分子相互作用的动力学过程，可揭示出以往检测多分子集体行为平均化所掩盖的“个性”和蕴藏的丰富信息，从而深入了解生命活动的微观规律。目前单分子检测技术主要有3大类：扫描探针显微术、化学方法和光学方法。这些方法实现单分子检测的共同特征是：(1)高空间分辨能力；(2)单分子性质和行为的捕获能力；(3)能收集微弱信号并放大检测，并做相应的分析处理以获取可信的信息。1．2．1扫描探针显微术扫描探针显微术包括扫描隧道显微镜(Sca

3、nningTunnelingMicroscopy，STM)、原子力显微技术(AiomForceMicroscopy，AFM)和扫描电化学显微术(ScanningElectrochemicalMicroscopy，SECM)等。STM利用针尖与样品在近距时的隧道电流，AFM利用针尖与样品直接接触时的力，SECM利用作为工作电极的探头上的氧化还原电流来获得单分子的图第一章绪论像f4】。由于这类技术可在常温常压下进行，而且空间分辨率很高(10。9--10郴m水平)，因此对于显示单个分子的形貌具有很大的优越性。目前应用AFM比较普遍，它不仅可以观察处于溶液状态的单个分子，更接近于

4、生理状态，而且可以测量力谱，即和大分子一部分接触，并通过施力与距离的关系了解分子的力学性质，特别适合于对生物分子折叠与解折叠的研烈31。1．2．2化学方法化学方法包括电化学检钡O(single．moleculeelectrochemicaldetection，SMED)和化学发光(chemiluminescence，CL)检测等。1．2．2．1电化学方法电化学方法检测主要是使用纳米微电极对电极附近纳米尺度范围溶液内的分子进行电化学测定，或是利用极快速的电势扰动技术，使扩散层仅限于纳米范围。Bard等【5】在纳米微电极上对单个三甲铵甲基二茂铁(Cp2FeTMA+)分子进行电

5、化学检测。Amatore等【6】基于超高速电势扫描技术，在微米级电极上实现了纳米尺度范围内的电化学检测。他们还将有64个活性中心的枝状大分子(Dend一64．[Ru“／Rum(tpy)2])吸附在半径约为5．01．tm的铂圆盘电极上形成单层膜，用具备超高速扫描功能恒电位仪研究了电子在这种枝状分子上氧化还原位点间的跳跃扩散，测定了电子在分子内的活性位点之间的自交换转移速率常数。1．2．2．2化学发光法化学发光具有分析速度快、灵敏度高、仪器简单、无需外加光源及信噪比高等特点，已用于有机荧光染料分子及生物分子的检测，缺点是化学发光选择性差、干扰严重。程介克等【7，8】利用毛细管

6、电泳在线化学发光检测对金属离子v(1V)的检测达到了分子水平。电化学发光是化学发光与电化学相结合的产物，它保留了化学发光的大多数优点，同时又具有许多化学发光无法比拟的优点，如重现性好、试剂稳定、容易控制和一些试剂可以重复使用等，从而引起了许多科学家的兴趣，有许多文章对其进行了评述⋯o，111。Bard掣121将DNA吸附到覆盖了一层烷基二磷酸铝薄膜的电极表面上，用Ru(phen)32+进行标记，在三丙胺存在下Ru(phen)32-4-2第一章绪论被氧化产生电化学发光，从而对DNA进行了检测。这为DNA、蛋白质等生物单分子的检测提供了一种可能的途径。1．2．3光学方法光学方

7、法包括共聚焦荧光显微法(1aserscanningcon_focalmicroscopy，LSCM)、全内反射荧光显微术(totalinternalreflectionfluorescencemicroscopy，TIRFM)、扫描近场光学显微镜(scanningnear-fieldopticalmicroscope，SNOM)等。1．2．3．1共聚焦荧光显微术在单分子光学检测中，共聚焦荧光显微术以其灵敏度高的特点成为目前应用最广泛的检测手段。共聚焦成像原理如图1．1所示：它是采用点光源照射标本，在焦平面上形成了一个轮廓分明的