高表达灵芝3-羟甲基戊二酰辅酶a还原酶基因提高灵芝酸的生产

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1、上海交通大学博士后学位论文高表达灵芝3--羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因提高灵芝酸的生产姓名：徐军伟申请学位级别：博士后专业：生物学指导教师：钟建江201109㈣'Y2㈣06删249㈣2㈣5高表达灵芝3．羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因提高灵芝酸的生产摘要灵芝酸是一类三萜化合物，具有抗肿瘤、抗HIV-1等重要药理活性，但较低的生产率制约着它的各种应用。通过基因工程的手段改造萜类生物合成途径是提高其生产的一种有效的方法，但至今在蘑菇类高等真菌中还未见相关报道。本文首先建立一种高等真菌灵芝的同源转化系统，并利用建立的转化系统高表达了灵芝酸生物合成途径的关键酶3．羟甲基戊二酰辅

2、酶A还原酶(HMOR)，研究了HMGR高表达对灵芝酸生物合成的影响。我们通过染色体步移的方法克隆得到了编码灵芝琥珀酸脱氢酶．铁硫蛋白亚基(s岫)的基因序列(包括启动子和终止子，3171bp)，对蛋白编码区的第216位组氨基酸进行了定点突变(HistoLeu，CACtoCTC)，获得了灵芝同源转化筛选标记动扩。利用西p建立了农杆菌介导的灵芝转化系统，转化后的灵芝细胞对杀菌剂Carboxin产生了抗性，说明突变的灵芝sdhB基因可以作为一种有效的同源筛选标记。PCR和Southernblot结果表明如≯基因已经整合到转化子的染色体上，并且插入的序列多为单拷贝。利用建立的

3、灵芝同源转化系统，我们构建了HMGR催化亚基(tHMGR)高表达的灵芝工程菌株，PCR结果表明tHMGR基因已转入灵芝细胞，荧光定量PCR(qRT-PCR)的结果显示工程菌株中HMGR基因的表达量是野生型的2．3倍。我们进一步动态分析了野生型(WT)，转化对照(TR)和tHMGR高表达(HMGR)的菌株中灵芝酸的积累，中间代谢产物(鲨烯和羊毛甾醇)的动态变化以及四个关键酶．HMGR，焦磷酸法呢酯合成酶(FPS)，鲨烯合成酶(SQS)和羊毛甾醇合成酶皿s)基因的表达情况。工程菌株中灵芝酸的含量比野生型菌株提高了2倍，中间代谢物鲨烯和羊毛甾醇的积累也高于相应的野生型菌株

4、，关键基因hmgt；,fro,sqs和豇的最高转录水平分别是野生型10，6．8，6．8和9．1倍，表明高表达tHMGR基因增强了灵芝细胞合成灵芝酸的能力。本研究阐述了在高等真菌灵芝中采用基因工程的手段提高灵芝酸积累的方法，为三萜类次级代谢产物灵芝酸的高效生产和调控提供了有用的信息。关键字：灵芝酸，灵芝，琥珀酸脱氢酶．铁硫蛋白亚基，同源基因转化，基因工程，3．羟甲基戊二酰辅酶A还原酶HEnhancementofganodericacidsaccumulationbyoverexpressionofanN．terminaltruncated3-hydroxy一3一met

5、hylglutarylCoA。basidiom，；teGanodermalucidumreductaseinbasidiomyceteuanoaealuctaumAbstractGanodericacids，asoneofthemostimportanttriterpeneconstituentsproducedbyGanodermaspecies，haveanumberofbiologicalfunctionssuch硒antitumorandanti-HIV-1activities．However,lowyieldsofganodericacidsinGluci

6、udummyceliaareinhibitingtheirvariousapplications．Geneticengineeringisapromisingapproachtoenhanceaccumulationofbioactiveterpenessuchasartemisinin，ginsenosidesandcarotenoid·However,tothebestofourknowledge，nostudyhasbeenconductedtoenhanceganodericacidsaccumulationthroughgeneticmanipulatio

7、nofthebiosyntheticpathway．Inthiswork,ahomologousgenetictransformationsystemwasfirstdevelopedforGluciudm·Then，the咖ncatedGlucidumHMGRgene(tHMGR)，codingthecatalyticdomainof3-hydroxy。3-methylglutarylcoenzymeAreductase，akeyenzymeoftheMVApathway,w嬲overexpressedbyemployingtheestablishedtran