貉、狐、貂源犬瘟热病毒的分离鉴定及生物学特性研究

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1、万方数据学校代码：10225学号：S14616学位论文貉、狐、貂源犬瘟热病毒的分离鉴定及生物学特性研究指导教师姓名：申请学位级别：论文提交日期：授予学位单位：吕九云张彦龙副教授东北林业大学硕士学科专业：生理学2014．4论文答辩日期：2014．6东北林业大学授予学位日期：答辩委员会主席：郑世民教授论文评阅人：聋必栉案大学万方数据UniversityCode：10225RegisterCode：I㈣2㈥350帅8眦Y27DissertationfortheDegreeofMasterIsolation

2、andidentificationofcaninedistepmervirusoriginatedfromraccoondog，foxandmink，andstudyonthebiologyproperties，-⋯一Candidate：Supervisor：AcademicDegreeAppliedfor：Speciality：Dateof0ralExamination：University：LvJiuyunZhangYanlongMasterPhysiology2014．6NortheastFo

3、restry万方数据摘要犬瘟热(CanineDistemper，CD)是由犬瘟热病毒(CDV)引发的一种急性、高度接触性致死性传染病。可感染犬科、鼬科、浣熊科、大熊猫科、猫科(猫除外)等多种动物，对我国养犬业和毛皮动物养殖业造成较大的经济损失。为此建立一种快速分离犬瘟热病毒的可靠方法尤为重要，以此对我国毛皮动物的犬瘟热病毒进行分离与生物学特性分析，为研制致弱毒株打下了基础。第一部分，从取皮期健康乌苏里貉肺脏中收集巨噬细胞，ELISA实验筛选阳性样本，用Vero细胞分离培养，蚀斑克隆纯化病毒，获得一株

4、疑似犬瘟热病毒。血清学实验、RT-PCR和F基因测序分析，证明该毒株确为犬瘟热病毒，命名为CDV／R-20／12。第二部分，应用淋巴细胞分离液获得健康的乌苏里貉淋巴细胞，将犬瘟热毒株CDV／R-20／12在淋巴细胞中培养，培养5代后仍可感染Vero细胞。由此决定尝试使用淋巴细胞进行野毒株的分离研究，将在临床上获得的毛皮动物(乌苏里貉、狐狸、水貂)首先以RT-PCR鉴定和诊断，筛选出10只CDV阳性病料，然后在获得的淋巴细胞中分离培养犬瘟热病毒。考虑到很多发病的毛皮动物有紧急接种的可能性，采用ARMS

5、．PCR区分是疫苗毒株和野毒株，进行5代培养，分离出5株野毒株。第三部分，从健康的乌苏里貉肺脏分离到的毒株CDV／R-20／12进行生物学特性验证分析。静注、皮下、滴鼻、口服、点眼、肌注等方式接种毒株CDV／R-20／12是安全的，并且不能感染同居的未接种动物。也证明了，毒株CDV／R-20／12在动物体内具有遗传的稳定性，并且能够刺激机体产生的中和抗体效价水平较高，结合ARMS-PCR(MuLtiplexAmplificationRefractoryMutationSystemPolymerase

6、ChainReaction)初步证明了毒株CDV／R-20／12是CDV弱毒株。第四部分，本研究将筛选出10个CDV阳性样本的F基因进行扩增，并分别将其克隆到pMDl8．TVector，进行序列测定。F基因序列同源性分析：测得CDVF基因序列与Genbank上已报道的CDV毒株相比较。lO个病毒株F基因序列同源性均达到97．2％以上，其中所测得毒株CDV-LNHCl和CDV-LNHC2同源性高达99．7％，氨基酸同源性为99．4％。测得序列与GenBank上的国内外CDVF基因序列同源性在90．6％

7、99．3％。与Thl2的同源率最高，在97．7％～99．2％之间：与毒株Shuskiy同源率最低，约为88．6％～90．2％。总体，10个野毒株与亚洲分离的毒株亲缘关系较近，与欧美等国的强弱毒株亲缘关系都较远。鉴于国内的多数疫苗仍使用欧美等毒株，本实验所测毒株的F基因和氨基酸分析与之差异较大，可见分离毒株具有一定的研究意义，可以作为今后的致弱毒株或生物学研究。关键词犬瘟热病毒：分离鉴定：PCR；生物学特性；F基因序列分析万方数据AbstractCaninedistemperisahighlycont

8、agiousandfataldiseasecausedbycaninedistempervirus(CDV)．ThevirusCaninfectcanine，mustelidae，raccoon，andotheranimals．Thediseasecausegreateconomicdamagetothedogandfuranimalbreedingindustry．Forthisreasontheestablishmentofarapidandreliablemet