人dc-sign重组蛋白表达、抗体制备及其应用

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1、分类号R392密级UDC610硕士学位论文人DC-SIGN重组蛋白的表达、抗体制备及其应用学位申请人：吕佰瑞学科专业：免疫学指导教师：刘朝奇教授二○一一年三月ADissertationSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofMedicinePreparationofRecombinantProteinandAntibodiesagainstHumanDC-SIGNandIt'sApplicationsinImmunoassayGraduateStudent:

2、LvBairuiMajor:ImmunologySupervisor:Prof.LiuChaoqiChinaThreeGorgesUniversityYichang,443002,P.R.ChinaMarch,2011三峡大学硕士学位论文三峡大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明，本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。学位论文作者签名：日期

3、：三峡大学研究生知识产权承诺书本人承认：我作为三峡大学硕士研究生在校学习期间，在导师指导下，依据研究工作所作学位论文的知识产权全部权归三峡大学所有。本人承诺：我有义务维护三峡大学的知识产权，凡是以我本人学位论文内的全部或部分研究成果，或实验数据为基础所形成的研究论文及成果，无论是以何种形式刊发学术论文、进行成果鉴定或申报奖励，均以三峡大学为第一作者单位或完成单位，并事先征得导师或学校相关部门的同意。我愿承担因违背上述承诺而引起的一切法津和经济后果。学位论文作者签名：日期：I三峡大学硕士学位论文内容摘要目的：为建立人DC-SIGN双抗体夹心ELISA方法

4、，制备抗DC-SIGN兔源多克隆抗体和鼠源单克隆抗体。以制备的多克隆抗体和单克隆抗体为基本检测试剂，进行检测DC-SIGN的双抗体夹心ELISA方法。方法：(1)以PBMC为模板用RT-PCR方法扩增人DC-SIGN基因，构建真核表达质粒pcDNA-DC-SIGN和原核表达质粒pET28a-DC-SIGN(ER)。(2)用纯化的DC-SIGN胞外区蛋白免疫日本大耳白兔，制备多克隆抗体。通过酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗体效价，免疫荧光法检测其特异性。(3)以纯化的重组人DC-SIGN胞外区蛋白免疫Balb/C小鼠，通过细胞融合技术，间接ELISA

5、筛选和3次以上细胞克隆，获得稳定分泌抗DC-SIGN蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株，制备单克隆抗体。(4)以获得的多克隆抗体和单克隆抗体为基本检测试剂，进行了双抗体夹心ELISA方法的探索。结果：(1)成功构建人DC-SIGN的原核表达质粒pET28a-DC-SIGN（ER）和真核表达质粒pcDNA-DC-SIGN。(2)使用纯化后的重组DC-SIGN胞外区蛋白免疫日本大耳白兔制备兔抗人DC-SIGN胞外区蛋白的多克隆抗体。ELISA结果显示，制备的抗体效价达到了1:32000，WesternBloting结果表明，制备的多克隆抗体能特异性与人DC-SIG

6、N重组蛋白结合，具有良好的反应原性。(3)成功获得稳定分泌抗人DC-SIGN单克隆抗体的杂交瘤细胞株；抗体效价为6.4xl04；免疫印迹实验中，单抗可与细胞内的DC-SIGN蛋白特异地结合；(4)使用多克隆抗体作为包被抗体，以制备的单克隆抗体为检测抗体，建立检测DC-SIGN的双抗体夹心ELISA方法模型。结论：成功制备了人DC-SIGN多克隆抗体和单克隆抗体，初步建立了检测DC-SIGN的双抗体夹心ELISA模型。关键词：DC-SIGN单克隆抗体多克隆抗体ELISAII三峡大学硕士学位论文AbstractObjectiveTosetupdouble-

7、antibodysandwichELISA.inoculaterabbitforpolyclonalantibodiesandmonoclonalantibodiesbyhybridomatechnologythemonoclonalantibodyandpolyclonalantibodywereusedasbasicdetectionreagentstosearchfordouble-antibodysandwichELISAfordetectingDC-SIGN.Methods(1)HumanDC-SIGNgenewasamplifiedfrom

8、PBMCbyRT-PCRandinsertedintopcDNAandpET28a(+)toc