副鸡禽杆菌外膜蛋白gcbg的原核表达及荚膜转运基因hctc缺失株的构建

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1、分类号：R737.1学校代码：10758密级：公开学号：1036020250硕士学位论文副鸡禽杆菌外膜蛋白gcbG的原核表达及荚膜转运基因HctC缺失株的构建ProkaryoticExpressionofOuterMembraneProteinGcbGofAvibacteriumParagallinarumandConstructionofItsMutantwithCapsuleTransporterGeneHctCDeleted研究生姓名赵成全导师姓名及职称冉多良教授合作导师姓名及职称王宏俊副研究员学位门类级别农学硕士专业名称预

2、防兽医学研究方向分子病毒学所在学院动物医学院新疆·乌鲁木齐二○一三年六月独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得新疆农业大学或其他教育单位的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年月日关于学位论文使用授权的说明本人完全了解新疆农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：新疆农业大学有权保留并向国家有关部

3、门或机构送交论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，允许论文被查阅和借阅。本人授权新疆农业大学将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以公布（包括刊登）论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日本文是国家“十二五”高技术研究发展计划(863)项目“副鸡禽杆菌体内诱导抗原的筛选鉴定及功能分析”（项目编号：2011AA10A210）的部分研究成果课题主持人:王宏俊（北京农林科学院）副鸡禽杆菌外膜蛋白gcbG的原核表达及荚膜

4、转运基因HctC缺失株的构建摘要鸡鼻炎是由副鸡禽杆菌引起的以鸡肿头肿脸为主要症状的急性呼吸道传染病，主要引起育成鸡生长发育受阻和淘汰率增加，且造成蛋鸡产蛋量明显下降，给我国养禽业造成了巨大损失。因此，进行Apg新型疫苗的研发，研制出对鸡安全、有效并能迅速产生免疫力的基因工程疫苗为当前研究的主要任务。本研究对B型标准株gcbG基因进行了克隆、测序，大小为495bp，将其插入pGEX-5X-1原核表达质粒中，构建pGEX-5X-gcbG原核表达载体，转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，获得gcbG蛋白原核表达菌株；对gcbG蛋白

5、进行表达、最佳表达条件的优化以及表达产物的免疫原性分析，结果表明，本实验成功地在体外表达了APg血清B型gcbG蛋白，大小约为44ku,该蛋白在IPTG浓度为1mM/L，温度为28℃，表达时间为5h，表达量最高，且为包涵体表达。纯化gcbG重组蛋白包涵体，进行Westernblotting检测，结果表明，目的蛋白与Apg鸡阳性血清有特异性免疫反应。对B型标准株HctC基因进行了克隆、测序，大小为1164bp，以副鸡禽杆菌标准株0221为实验基础，利用转座子采用定点克隆的方法，扩增其全长片段，将其连入pGEM-T载体，通过反向PCR

6、并反向自连后获得基因缺失片段，将基因缺失片段转入pemoC2自杀质粒构建基因缺失转移载体。在成功构建基因缺失转移载体的基础上，将其电转入副鸡禽杆菌感受态细胞中，通过自杀质粒介导的同源重组方法得到副鸡禽杆菌HctC基因缺失株。结果表明，Apg基因缺失菌株菌体形态与野生菌株无显著差异，生长速度并未受明显影响。关键词：副鸡禽杆菌；GcbG基因；HctC基因；基因缺失菌株IProkaryoticexpressionofoutermembraneproteingcbGofAvibacteriumparagallinarumandConstr

7、uctionofitsmutantwithcapsuletransportergeneHctCdeletedAbstractInfectiouscoryza,causedbyAvibacteriumparagallinarum,isanacuterespiratorydiseaseofchickenswithcardinalsymptomHeadTumidness.Thisdiseasecausesgrowthimpedimentandraiseseliminatingrateforchickens,whichhasledtoag

8、reatlossforChinaPoultryIndustry.Thereforeresearchonthedevelopmentofnew-typegeneticengineeringvaccinewhichissafe,effectiveinp