(三)网织红细胞计数

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1、实验三网织红细胞计数一、实验原理网织红细胞胞浆内残存有嗜碱性的RNA物质，经煌焦油蓝或新亚甲蓝活体染色后RNA中负电荷基团与带正电荷的有色基团结合，凝聚成颗粒呈浅蓝或蓝黑色的点状、丝状或网状结构，可在显微镜下识别。计数1000个红细胞中所有的网织红细胞数直接报告其百分比，或×红细胞计数结果报告其绝对值。网织红细胞（Ret）是晚幼红细胞脱核后到成熟红细胞间的过渡细胞，是尚未完全成熟的红细胞，其胞浆内残存有嗜碱性的RNA物质。嗜碱性物质与染料凝聚成蓝色颗粒，颗粒与颗粒连缀成线，线连接成网，故而得名。分型：丝球型、网型、破网型、点粒型。（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型）网织红细胞计数方法1、

2、普通光学显微镜法：活体染色后推片镜检2、网织细胞计数仪法：荧光染色后用流式细胞术计数二、试剂器材1、试剂10g/L煌焦油蓝酒精（水）溶液2、器材毛细血管采血用具、小试管、载玻片、推片、显微镜、香柏油、二甲苯及擦镜纸、Miller窥盘或直径约20mm（较目镜内径稍小）的圆形硬纸片（正中央开一边长为3mm的菱形或正方形小孔，置目镜光阑处，用于缩视野法计数）三、操作步骤1.染色：于载玻片的一端加煌焦油蓝酒精溶液1滴，任其自然凉干后备用，取末梢血或抗凝血一滴，于已干燥的染料上，用推片角混匀后，将两玻片盖合（玻片法）；试管法取染液2滴入试管，加血2滴混匀，封闭好，待15分钟以上时间

3、，2.推片：取混合液1小滴于载玻片的一端，推制成薄而均匀的血膜，3.低倍镜浏览，选取红细胞分布均匀网织红细胞染色较好的部分（体尾交界处），滴香柏油转换至油镜，在Miller窥盘下计数小方格中的RBC数和大方格中的网织红细胞数（或数出整个视野中的RBC总数和其中的网织红细胞数，换一视野同法计数至几个视野RBC总数>1000为止）。Miller窥盘A31B将Miller窥盘放在显微镜目镜中,通过窥盘中大小方格间的9比1比例关系计算RBC数和Ret数。四、计算1.Miller窥盘法：网织红细胞（Retic）百分率(%)=（大方格内Retic总数）/（小方格内RBC总数×9）×1

4、00%2.直接计数法：网织红细胞（Retic）百分率(%)=多个视野内Retic总数/多个视野内RBC总数×100%五、注意事项1.用酒精染液时，应待玻璃片上的酒精挥发干燥后，才能加血液，染色时应用推片角不停搅动，使染料和血液混合，防止凝固。2.染色时间一定要充足，混合后不能立即推片，室温低时染色时间应适当延长，应覆以另一玻片防止蒸发。3.染液与血液比例以1：1为宜，贫血适当加血量。4.涂片厚薄均匀适宜，弓形移动，多个区域计数5.试剂应定期重配，以免变质沉淀。6.与变性珠蛋白小体鉴别六、参考值成人：0.005-0.015（0.5%-1.5%）新生儿：0.02-0.06（2

5、%-6%）儿童：0.005-0.075（0.5%-7.5%）成人绝对值（24-84）109/L七、临床意义（1）评价骨髓增生能力，判断贫血类型再障时，明显降低。绝对值低于5×109/L可做为急性再障的辅助诊断指标。失血、多数溶血性贫血患者网织红细胞可明显高于正常。营养不良性贫血在治疗前网织红细胞可保持正常、轻度升高或降低。（2）评价疗效网织红细胞反应：IDA或巨幼细胞贫血分别给予铁剂、维生素B12或叶酸治疗2~3d后，网织红细胞计数值开始上升，7~10d达到最高(10%左右)；两周以后逐渐降至正常水平，红细胞、血红蛋白开始升高。骨髓移植、EPO治疗后：若骨髓开始恢复造血

6、功能，RMI升高，网织红细胞计数值上升。（3）放、化疗监测机体接受放、化疗后，如出现骨髓抑制，早期HFR和MFR降低，然后才检测到网织红细胞的降低。而停止放、化疗，骨髓功能恢复后，又见上述指标依次上升。可指导临床医师适时调整治疗方案，避免造成严重的骨髓抑制。RPI=病人网织红细胞（%）/2*病人HCT/正常人HCT（男0.45，女0.40）临床应用：＞3提示溶血性贫血或急性失血性贫血；网织红生成指数（Reticulocyteproductionindex,RPI）八、思考题一溶血性贫血患者，红细胞计数2.6x1012/L，血细胞比容0.29，网织红细胞计数相对值为35%，

7、如何报告网织红细胞检测结果？外周血网织红细胞计数（百分数和绝对值）是一反映骨髓红系增生活性的常用指标。许多学者先后提出应用FCM和不同的RNA特异性荧光染料自动计数网织红细胞的方法，如派若宁Y、AO、溴化乙啶、thiazoleorange等。   目前最普遍应用的是thiazoieorange染色法，这种特异性RNA的激发波（488nm）测量的特点，与人工计数法相比，它不但能得到网织红细胞的百分数和绝对值，而且还能获得网织红细胞成熟指数（RMI）。RMI是一个检测骨髓功能的独立实验室指标，它与网织红细胞内RNA含量成正比，R