ship基因在白血病发病机制中作用的研究

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1、河北医科大学博士学位论文SHIP基因在白血病发病机制中作用的研究姓名：杨琳申请学位级别：博士专业：内科学指导教师：罗建民20090401中文摘要SHIP基因在白血病发病机制中作用的研究摘要背景：白血病是原发于造血系统的恶性肿瘤。近年来，其发病率呈增加趋势。在35岁以下人群中，白血病的死亡率占恶性肿瘤第一位，严重危害中青年人的生命，所以值得特别重视。急性白血病的发生包括了复杂的基因突变、缺失、癌基因激活及抑癌基因失活等多种分子生物学水平的异常。尽管许多基因在白血病发病中的作用及其机制已初步明确，但所有的基因异常仍不能解释全部白血病的发生机制，因此，寻找新

2、的白血病相关基因并研究其生物学功能一直是白血病研究领域的热点之一，不仅有助于阐明白血病发生发展的机制，而且可能找到一些治疗靶位点。SHIP基因是继PTEN之后发现的仅在造血细胞表达的一种新的肌醇磷酸酶，其主要功能是降解PIP3成为P13，4P2而负调控P13K／Akt路径。本课题组多年来一直围绕SHIP基因功能与白血病发生发展关系开展研究工作，取得了一系列有意义的研究成果。我们首次报道急性白血病患者存在SHIP基因突变，并证实SHIP基因低表达和表达缺失与人白血病细胞恶性增殖密切相关，通过干扰RNA封闭K562细胞的bcr／abl融合基因使SHIP蛋白

3、重新表达并可以逆转细胞的异常增殖表型，近年来也陆续发现和报道了一些白血病细胞中新的SHIP基因突变。这些都提示SHIP基因具有调控白血病细胞增殖、凋亡的结构基础。但是，有关SHIP基因调控白血病细胞系K562的P13K／Akt信号传导通路的分子机理及其在抑制和／或逆转K562细胞增殖能力中的地位，以及SHIP基因突变对P13K／Akt的调控有何改变等问题，目前国内外均无报道。本研究的目的是：(1)探讨野生型SHIP基因对人白血病细胞系K562中P13K／Akt信号通路相关蛋白表达水平的影响；(2)构建携带突变型SHIP基因的慢病毒载体并转染K562细胞

4、系；(3)探讨SHIP基因突变后在K562细胞中的功能变化，为进一步研究SHIP基因在白血病发病机制中的作用提供实验依据。第一部分野生型SHIP基因对白血病细胞系K562增殖凋亡的实验研究目的探讨肌醇5，磷酸酶基因SHIP对人白血病细胞系K562增殖、中文摘要凋亡及细胞周期的影响，并对其可能的作用机制进行初步探讨。方法将携带有野生型SHIP基因和空载体的慢病毒表达载体转染人白血病细胞系K562。MTT检测细胞生长情况；流式细胞仪检测细胞转染效率和细胞周期分布；显微镜及透射电镜下观察细胞形态及超微结构改变，TUNEL、Hoechst33342荧光染色、细

5、胞集落形成等实验检测细胞增殖及凋亡情况。实时荧光定量PCR(FQ—PCR)检测转染前后SHIPmRNA表达变化，WesternBlot检测各转染组SHIP、Akt、P—Akt308、P．Akt473、Bcl．2、Bax、Bad、Bcl．xL、CyclinDl、p27kipl、p21WAFl、NFKB蛋白水平变化。Caspase活性检测试剂盒检测Caspase．3、Caspase一9活性。NFKB活性检测试剂盒检测NFKB活性变化。结果1转染48h后，流式细胞仪检测慢病毒载体转染K562细胞效率为(74．6+5．8)％。FQ—PCR矛DWestemblo

6、t显示，转染SHIP基因后K562细胞中SHIP呈高效表达，表明转染成功。2转染野生型SHIP基因的K562细胞表现为增殖受抑，增殖指数减低，克隆形成能力降低，DNA合成减少和凋亡增多，与转染空载体组和未转染组相比有统计学差异(尸

7、禾DAkt473磷酸化水平(分别为：0．125+0．016，0．351+0．064)明显低于K562／FIV细胞(Akt308：0．323+0．025，Akt473：0．788+0．102)和未转染组(Akt308：0．32410．023，Akt473：0．801+0．095)(P<0．01)，后两组间Akt一308和Akt473磷酸化水平均无统计学差异(P>O．05)。5野生型SHIP基因抑制IL．3诱导的K562细胞增殖，发现外源性野生型SHIP蛋白表达组K562细胞P．Akt308君Dp．Akt473水平增加程度明显低于对照组呈下降趋势，而总Ak

8、t表达水平无明显变化；撤除IL．3刺激后，K562／嘶SHIP组细胞Akt磷酸化水平快速下降，