新型双功能糖苷酶的表达纯化及功能研究

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1、硕士学位论文论文题目新型双功能糖苷酶的表达纯化及功能研究研究生姓名张馨月指导教师姓名郭亚军专业名称免疫学研究方向抗体工程论文提交日期2013.041新型双功能糖苷酶的表达纯化及功能研究中文摘要中文摘要目的：抗体的糖型对抗体的功能有着极其重要的影响，PNGaseF和EndoF2是糖苷酶家族中的重要成员，在抗体和抗体糖型的鉴定中发挥着重要作用，但这两种酶的酶切最适pH值差异巨大，无法在同一pH的缓冲液下进行抗体单步酶切，并且PNGaseF无法切除位于抗体Fab段的糖链。若抗体在多个部分有糖基化修饰，那么就要两种酶进行多步酶切，而这

2、会对后期抗体及其糖型的检测造成不可控的影响，如何在同一pH下使两种酶均能发挥作用目前尚未有研究。方法：分别通过全基因合成得到PNGaseF及EndoF2基因片段，采用大肠杆菌进行表达，纯化过后得到了PNGaseF及EndoF2，然后通过晶体模拟及蛋白参数的运算，决定采用融合蛋白的方式来完成EndoF2的pHshift，确定了通过串联两段基因进行表达的可行性，将EndoF2及PNGaseF基因串联片段克隆到pET32a+载体上，并诱导大肠杆菌表达获得大量重组可溶性的糖苷酶，进而采用两步纯化，得到具有活性的高纯度“融合酶”。采用该

3、酶进行抗体酶切，并通过质谱及SDS-PAGE来进一步确定“融合酶”pHshift的有效性。结果：通过串联表达构建的“融合酶”不但实现了可溶性表达，可以应用于宽泛的pH范围，可在同一pH缓冲液中同时发挥两种酶的作用，并且可以在非变性的条件下有效地切除抗体中FC及Fba上的糖链，具有很好的脱糖基的作用。结论：EndoF2和PNGaseF融合表达后，形成了一种新型双功能酶，成功地实现了pHshift。该“融合酶”可在同一pH下良好的发挥相应作用。很好的解决了当抗体中有多个糖基化位点时的酶切鉴定问题。关键词：EndoF2；PNGase

4、F；融合酶；pHshift；脱糖作用作者：张馨月指导教师：郭亚军教授王皓教授I英文摘要新型双功能糖苷酶的表达纯化及功能研究Expression,purificationandbioactivitycharacterizationofanovelbifunctionalEdnoF2/PNGaseFglycosidehydrolaseAbstractObjective:Thefunctionsofantibodycanbeaffectedbyglycosylationpatterns.PNGaseFandEndoF2,bothof

5、themareimportantmembersofglycosidasefamily,whichplayagreatroleinglycosylationidentificationofantibodies.ButtheiroptimumpHdiffersgreatly.Besides,PNGaseFcannothydrolyzethesugarsofFab.Ifthereismorethanoneglycosylationsiteinanantibody,bothoftheenzymesshouldbeused.Butthe

6、iroptimumworkingpHistoodifferenttoworkinthesamebuffer,thereforedifferentbufferandpHvalueshouldbeused,butthatwillmakemanyinfluencinguncontrollablefactors.HowtousethetwoenzymesinthesamebufferandpHhasn`tbeenreported.Methods:ThePNGaseFandEndoF2sequencesgeneareobtainedby

7、artificialgenesynthesis,andexpressedinE.coli,andthenwepurifiedthetwoenzymesusingchromatographymethods.Byanalysingtheproteincrystalmodelandproteinparameters,wecalculatedthatbyusingthefusionmethodtoreconstructthetwoenzymesisavailable.ThenthefusednucleotidesequenceEndo

8、F2-Linker-PNGaseFwasinsertedintopET32a+prokaryoticexpressionvector,andthenoverexpressedinE.coliBl21(DE3)cellsbyIPTGinduction.Ni-NTAandanio