果实蛋白质组学研究的实验方法

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1、植物学报ChineseBulletinofBotany2009,44(1):107-116,www.chinbullbotany.com.技术方法.果实蛋白质组学研究的实验方法王清1,2,产祝龙1,秦国政1,田世平1*1中国科学院植物研究所,光合作用与环境分子生理学重点实验室,北京100093;2中国科学院研究生院,北京100039摘要双向电泳技术是蛋白质组学研究的基本方法之一。果实由于富含糖、多酚、单宁和有机酸等物质，蛋白质的提取比其它植物组织更加困难。本文主要介绍不同果实蛋白质的提取、等电聚焦系统和凝胶染色技术，并建立了一套适用于桃、樱桃、苹果、芒果和冬枣等多种果实蛋白质组学的研究方法。结

2、果表明，采用匀浆法和酚抽提法提取果实的蛋白质，裂解缓冲液2溶解蛋白质，并用固相pH梯度进行等电聚焦，可以获得背景清晰和分辨率高的凝胶图谱，具有较好的重复性，可用于果实蛋白质组学的研究。我们的研究结果显示，固相干胶条与IEF管胶相比，具有更加明显的优势。而不同的染色方法，对结果影响不大。关键词果实,凝胶染色,等电聚焦,裂解缓冲液,蛋白质提取王清,产祝龙,秦国政,田世平(2009).果实蛋白质组学研究的实验方法.植物学报44,107-116.果实生长发育阶段的生理代谢变化,以及采后处理1970)。因此,建立蛋白质提取的有效方法和标准化技对果实品质的影响一直受到人们的关注。在过去的研术体系对于果实蛋

3、白质组学研究十分必要。究中,我们发现生物和非生物因子处理果实可以激发抗本文在借鉴模式植物蛋白质提取方法的基础上,建氧化酶类和防御基因的表达(ChanandTian,2006;Tian立了一整套适用于多种果实,如甜樱桃(Prunusetal.,2007)。为了进一步研究果实应答生物因子和非avivum)、桃(Prunuspersica)、苹果(Malus生物因子过程中参与表达的蛋白及其功能,利用蛋白质domestica)、芒果(Mangiferaindica)和冬枣(Ziziphus组学的研究方法来揭示果实抗性应答的机理是十分重要jujuba)的蛋白质组学研究方法,包括蛋白质的抽提、的手段。蛋白

4、质裂解液的优化、双向凝胶电泳以及凝胶染色蛋白质组学技术包括蛋白质的高分辨率电泳分离、方法等。胶内酶解、质谱鉴定以及数据库搜索等。如今,蛋白质组学技术已经被广泛地应用于动物和微生物领域的研1材料与方法究(Antelmannetal.,1997;Qinetal.,2007),在植物生物学方面也有广泛的应用(Dominguez-Puigjaneret1.1实验材料al.,1992;Changetal.,2000)。植物细胞中包含许多桃(PrunuspersicaL.Batsch)采于北京市平谷的试验次生代谢物质,可能会干扰蛋白的提取、分离及纯化果园,甜樱桃(PrunusavivumL.‘Hongde

5、ng’)采于中国(Granier,1988;Meyeretal.,1988)。而从果实组织科学院植物研究所的试验果园,苹果(Malusdomestica中提取蛋白质更加困难,可能是由于果实中蛋白质含量Borkh‘Fuji’)采于中国农业科学院林果所果园,芒果相对较低,并且含有大量干扰性物质,如色素、淀粉、(MangiferaindicaL.‘Zill’)和冬枣(Ziziphusjujuba多酚、多聚糖、单宁和有机酸类等(Clements,Mill.‘Dongzao’)分别采自四川省攀枝花市和山东省滨收稿日期:2008-04-22;接受日期:2008-05-10基金项目:国家自然科学基金(No.

6、30671473,U0631004)*通讯作者。E-mail:tsp@ibcas.ac.cn108植物学报44(1)2009州市。果实采摘后直接运回实验室,剔除伤果和病果,酚提取法(Phe)根据Saravanan和Rose(2004)的方挑选出大小均一的果实,用1%的次氯酸钠溶液消毒,法并加以改进。称取4g果肉,用液氮在研钵中研磨成清洗后晾干。粉。然后加入4mL的匀浆缓冲液(匀浆液中含有20mmol.L-1Tris-HCl(pH7.5),1.05mol.L-1sucrose,101.2蛋白质提取mmol.L-1EGTA,1mmol.L-1PMSF,1mmol.L-1DTT以下所有步骤均在4°C

7、条件下进行。以及1%TritonX-100)继续研磨。匀浆液以20000×gTCA法(TCA)参照Sarry等(2004)的方法并稍加改离心30分钟。上清液中加入等体积的pH为7.8的Tris-进。用取样器从10个果实中分别取4g果肉,用液氮饱和酚,充分摇荡,混匀,10000×g,4°C下离心30分在研钵中将其研磨成粉。然后加入4倍体积冰冷的10%钟,上层为酚相,中间白色物质为杂质,下层为水相。回