应用于靶向测序的多重PCR引物设计系统

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1、应用于靶向分析测序的多重PCR引物设计系统学校代码：10255学号：2160640硕士学位论文MASTERTHESIS应用于靶向测序的多重PCR引物设计系统AmultiplexPCRprimersdesigningsystemfortargetedsequencing学科专业生物工程研究方向生物信息学作者王亚恒指导教师李凯副教授校外导师杨志军总经理答辩日期2018年5月26日应用于靶向分析测序的多重PCR引物设计系统应用于靶向测序的多重PCR引物设计系统摘要背景：近年来随着技术进步与价格降低，高

2、通量测序日益已成为生物学领域的一种重要技术手段。靶向测序，是一种旨在捕获基因组特定区域DNA并进行高深度测序的方法，它在精准医学、群体遗传学、癌症测序、QTL区段候选基因重测序、线粒体重测序、分子育种背景选择、遗传性疾病检测等方面有广泛的应用。特别在临床上，用于鉴定遗传性疾病突变与肿瘤突变等，是高通量靶向测序技术发展较快的应用方向。靶向测序相对于全基因组或全外显子测序，其优势在于使用基于多重PCR技术或寡核苷酸探针杂交的快速富集方法、其针对性募集目的区域DNA进行测序，提高了测序深度，有效的降低

3、了测序成本且缩短研究时间。多重PCR技术的一个关键点，是设计合理的多重PCR引物对组合、确保引物组合中没有重叠扩增子，以及减少引物之间的相互作用。目前，多重PCR引物设计可以通过引物设计软件进行，国内外相关的免费软件有PrimerStation、MultiPLX、MPprimer和BatchPrimer3等，但缺乏特定应用于多重PCR靶向捕获引物设计软件，以致当前用于多重PCR靶向捕获引物设计流程，多通过不同软件组合联合使用来完成的，过程颇多繁杂、太耗时间和人力，因此一款个性化用于靶向测序的多重

4、PCR引物设计软件亟待开发。应用于靶向分析测序的多重PCR引物设计系统本文开发个性化用于靶向测序的多重PCR引物设计软件的主要任务，可分为三个部分：首先，建立UCSC本地基因注释（HG38基因组）数据库，实现本地输入目标基因或目标区域直接获取DNA序列模块，避免用户频繁使用NCBI或Ensembl数据库检索下载相关序列；其次，针对目前大多数多重PCR引物设计引物时不能覆盖全部目标区域的情况，开发了基于primer3-py的多序列候选引物设计模块；最后，开发了评估引物之间相互作用和检测引物之间形成

5、重叠扩增区域并自动化分组的模块。1.建立本地目标序列获取模块使用了数据比较稳定的UCSC数据库，下载其人类基因组参考序列文件与基因注释信息文件（包括基因名，基因外显子个数，基因所在染色体，外显子起始物理位置和终止位置等），利用关系型数据库管理系统MySQL建立了一个本地基因注释信息数据库。将基因注释信息、基因序列文件整合到了整个模块中。本模块实现的功能为：接收用户输入的目标基因或目标位置信息，然后将输入的信息转换为DNA序列信息，可用于引物设计。2.多序列候选引物设计模块虽然现有的多重PCR引物

6、设计软件多种多样，但这些软件大多是基于primer3进行特定用途而开发的，应用于靶向测序的多重PCR引物设计时，操作麻烦、费时，而且随着目标序列增多，还会造成程序因为没有合适的引物对组合返回而提前终止。因此，针对应用于靶向测序的多重PCR引物，本系统以primer3应用于靶向分析测序的多重PCR引物设计系统为基础重新开发多序列候选引物设计模块。该模块在搜索目标序列中所有的候选引物对时主要以引物自身因素（例如，引物GC含量、引物溶解温度Tm、引物长度等），PCR产物长度作为限制条件，而不考虑引物之

7、间形成稳定的二级结构。由于多个目标序列之间的引物设计过程相互独立，使用多进程并行的方式加快引物设计过程。在靶向测序的多重PCR引物设计过程中，如何得到每个目标区域序列的所有候选引物对集合，判断每个目标区域是否存在覆盖全区域的引物对集合，是用于靶向测序的多重PCR引物设计软件的关键问题之一。在每个目标区域中，首先对该目标区域所有的候选引物对按扩增子上游引物起始位置进行排序，然后遍历候选引物对组，更新每次要覆盖的区域，直到覆盖全部目标区域为止，或者当存在不能覆盖的区域时，就提前终止遍历。3.根据预扩

8、增引物组中引物之间相互作用和重叠区域进行分组目前，用于多重PCR引物分析的软件不少，但大多数都是仅仅分析引物组中形成新的扩增子发生非特异性扩增、引物之间形成稳定的二级结构等情况，但没有给出分组的解决方案。引物分组软件MutiPLX虽然能计算引物之间的相互作用并实现自动分组，但没有考虑引物之间形成重叠的扩增子情况。因此，本系统使用primer3的热力学比对模块，开发了根据引物对之间的重叠情况和引物之间形成二级结构的分组模块。该模块首先从多序列候选引物设计模块设计的候选引物中选择一组合适的引物组合；