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《菊粉酶酶源菌株筛选及其基因克隆》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、!"卷#期微生物学报&’()!".’)#"$$"年%月!"#$%&"’()&(*(+&"$,&-&"$*+,-"$$"!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!菊粉酶酶源菌株筛选及其基因克隆张苓花王运吉"叶淑红张福琪（大连轻工业学院食品科学与生物工程系大连//%$$/）摘要：筛选出一株产菊粉酶酶源菌株56/$，鉴定为黑曲霉（!"#$%&’(()"*’&$%）。789扩增56/$的内切菊粉酶基因’*)5/并进行核苷酸序列分析。结果表明’*)5/全长/11/:;，没有内含子，所编码的氨基酸序列中，存在!个潜在的.4
2、糖基化位点，其中存在菊粉酶的保守序列<=.>7.。以;?8//@为克隆载体，以+),-(’*=/$0为受体菌株，获得菌粉酶基因克隆。关键词：黑曲霉，菊粉酶，基因克隆中图分类号：A@/"文献标识码：5文章编号：$$$/4%"$0（"$$"）$#4$#"/4$1［/，"］菊粉酶（B,+(C,DE-’FB,+(DE-）可分为两类，一类是内切菊粉酶（>,G’C,+(C,DE-，>8#)")/)2），主要水解产物是寡聚糖；另一类为外切菊粉酶（>H’C,+(C,DE-，>8#)")/)@$），水解产物主要是果糖。菊粉酶广泛存在于植物和微生物中。利用菊粉酶水解菊粉生产寡聚果糖或超高果
3、糖浆，具有巨大的工业应用潜力。野生型微生物菊粉酶表达量比较低，利用基因工程技术构建菊粉酶基因工程菌，有望提高菊粉酶的表达量。国外已报道了来源于节杆菌（!%./%-01,.$%E;)）、克鲁维酵母（2()34$%-53,$"）、青霉（6$*’,’((’)5）、黑曲霉（!"#$%&’(()"［#I%］*’&$%）及无花果曲霉（!"#$%&’(()"7’,))5）等内切菊粉酶基因的分子克隆。本文报道菊粉酶酶源菌株的筛选及其内切菊粉酶基因的克隆和序列分析。!材料和方法!"!菊粉酶产生菌分离样品菊芋根部土壤。!"#菊芋采自野生菊芋。!"$培养基!"$"!初筛培养基：菊粉"$J，蛋
4、白胨/$J，酵母膏/$J，琼脂"$J，定容至/K。（菊粉单独灭菌，加入已熔化并冷却到1$L的琼脂培养基中，混匀制平板）。!"$"#复筛培养基：菊芋/$J，酵母膏1J，氯化钠1J，磷酸氢二钾#J，;M%N$，定容至/K。!"$"$察氏培养基：按文献［2］方法配制。!"$"%KO培养基：按文献［@］方法配制。!"%菌种和质粒+),-(’*=/$0、质粒;?8//@购自日本宝生物工程（大连）有限公司。"通讯作者作者简介：张苓花（/0123），女，辽宁省大连市人，大连轻工业学院教授，主要从事微生物和分子生物学教学及科研工作。收稿日期："$$/4$24"#，修回日期："$$/4/
5、/4"%>((微生物学报E(卷!"#试剂!"#提取液：在$%&’水中加入(%&’)%%&&*+,’-./0123（+4256%）和7&’)%%&&*+,’8!-#（4276%），加水定容至9%%&’。菊粉为0/:&;公司产品，!"#聚合酶、<3=产物回收试剂盒等购自日本宝生物工程（大连）有限公司。!"$菊粉酶酶源菌株的筛选!"$"!初筛：取分离样品于无菌生理盐水中，>%?，97%.,&/@振荡>%&/@，按不同稀释度涂布于初筛培养基上，培养(A>B，挑选透明圈直径与菌落直径之比较大的菌株。!"$"%复筛：初筛得到的菌株，接种于>%&’发酵培养基中，>%?，9)%.,&/
6、@摇床发酵，跟踪测定菊粉酶活性，从中筛选高产菌株。［5］!"$"&菊粉酶活性测定：菊粉酶活性单位定义：42)C)、))?条件下每分钟水解底物生成9还原糖所需的酶量为一个酶活单位。酶活性测定：以(D菊粉为底物，42EC$，!&*+)%?水解9)&/@，用>，)1二硝基水杨酸测定产生的还原糖量。［’］!"’菊粉酶酶源菌株的鉴定!"’"!菌落形态观察：将待鉴定菌株涂布于察氏培养基平板上，(7?培养，(周内跟踪观察菌落形态。镜下形态观察：在涂有察氏培养基的盖玻片上接种待鉴定菌，置于培养皿中，加入甘油保湿，(7?培养，E天内跟踪观察其镜下形态。!"(菊粉酶基因克隆［9%］!"("
7、!提取黑曲霉#F9%基因组"!#：#F9%活化后接种于(%%&’马铃薯液体培养基中，(7?、9>).,&/@摇床培养(G，离心并洗涤菌丝体。无菌研钵中，用液氮将菌丝体迅速研磨成粉末状。在9C)&’离心管中加入约%C9:菌体和)%%提取液，振荡使之充分混!’!"#合，再加入9%%、氯化苄>%%，剧烈振荡使管内混合物成乳状，在)%?保温9G。!’9%DH!H!’然后加入>%%（<2)6(）混匀，冰水浴9)&/@，$%%%.,&/@离心9)&/@，收集上清!’>&*+,’";#3液。加入等体积无水乙醇室温沉淀(%&/@。9%%%%.,&/@室温
