靶向fmdv受体整联蛋白β6亚基的sirna抑制病毒复制的研究

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1、分类号：密级：学号：2010108054单位代码：10759石河子大学硕士学位论文靶向FMDV受体整联蛋白β6亚基的siRNA抑制病毒复制的研究学位申请人张文智陈创夫教授指导教师王鹏雁副教授申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称预防兽医学研究方向畜禽病原分子生物学所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2013年6月siRNATargetstoFMDVReceptorIntegrinβ6SubunittoInhibitVirusReplicationADissertationSubmittedtoShihez

2、iUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofNaturalScienceByZhangWen-zhi(PreventiveVeterinaryMedicine)DissertationSupervisor:Prof.ChenChuang-fuAssociateProf.WangPeng-yanJune，2013ShiheziXinjiangChinaII课题来源课题名称：转基因生物新品种培育国家重大专项项目编号：

3、2009ZX08005-003BIIIII摘要目的：整联蛋白是一种介导病毒侵入宿主细胞内的细胞受体，在病毒粘附过程中发挥重要作用。本研究利用RNA干扰技术，对口蹄疫病毒（Foot-and-mouthdiseaseveirus,FMDV）受体整联蛋白β6亚基的胞浆域进行修饰，抑制其表达，从而抑制病毒侵入宿主胞内复制。这为后续抗口蹄疫转基因猪的获得奠定了基础。方法：以猪整联蛋白β6亚基为目的基因设计7对siRNA干扰分子。根据siRNA的筛选原则，筛选出对β6受体基因具有干扰作用的siRNA，并合成shRNA。

4、构建了7个干扰载体。将鉴定正确的干扰载体大提质粒，并用乙醇沉淀的方法纯化、浓缩质粒。利用组织块法和酶消化法分离怀孕32天的皮特兰猪胚胎成纤维细胞，用20%FBSDMEM培养基于5%CO2培养箱内培养。利用X-tremeGENEHPDNA转染试剂盒将干扰质粒转染至猪胚胎成纤维细胞和BHK细胞中，通过荧光倒置显微镜观察PEF细胞内干扰质粒绿色荧光蛋白的表达情况。利用实时定量（qRT-PCR）技术对每个干扰载体进行效果验证。将干扰效果好的载体酶切后，连接至PXL-EGFP-NEO整合载体上，大提质粒，乙醇纯化浓缩

5、后转染PEF细胞。对转染后的细胞进行G418筛选，获得纯化后的PEF细胞，并大量扩繁。qRT-PCR检测整合载体的抑制效果及病毒复制量，并进行攻毒检测。结果：在NCBI上搜索获得猪整联蛋白β6亚基的基因序列，其序列编号为EF432729，并将其与鼠源整联蛋白β6亚基基因序列在DNAMAN上比较，其同源性为84.75%，而在靶区域的同源性为93.55%。针对靶区域设计合成了7对siRNA，并构建了7个干扰载体，分别命名。通过测序获得正确的干扰载体。大量提取干扰载体质粒，并利用乙醇沉淀技术纯化质粒，并将其浓缩至

6、3000ng/μL以上。分离得到的PEF细胞于F1代冻存，共72管，保存于液氮罐中。将干扰质粒转染至F2代PEF细胞。通过对转染条件的优化，获得相对较高的转染效率。提取转染干扰质粒的PEF细胞RNA，反转录为cDNA，利用qRT-PCR技术分析干扰质粒抑制猪整联蛋白受体β6亚基的表达情况，并筛选出pGsi-Z4干扰效果较好的质粒，其干扰效果为91.7%。构建具有较好干扰效果的整合载体，依据PXL-EGFP-NEO整合载体上neo抗性，利用G418筛选转染后的PEF细胞，并大量扩繁。利用qRT-PCR分析整合

7、载体的干扰效果。转染后36h，其抑制细胞受体效果较好。进行攻毒实验，并通过qRT-PCR分析病毒复制量。结果显示，在攻毒后24h和36h，可以减少病毒的复制。结论：针对猪整联蛋白受体β6亚基胞浆域设计siRNA，在PEF细胞内，最终获得了干扰效果较好的pGsi-Z4载体，其能够有效的抑制受体β6亚基基因的表达，减少了病毒侵入细胞内的数量，从而发挥抑制病毒在胞内大量复制的作用。在利用该载体阻断BHK细胞β6基因表达时，pGsi-Z4的siRNA与靶位点存在一个碱基的差异，因此并不能达到较理想的效果。而pGsi

8、-Z5与靶位点则完全同源，在BHK细胞内可以发挥一定的抑制作用。构建的整合载体在转染后36h干扰效果相对较好。在检测病毒的实验中，感染后24h和36h表现出相对较好的减少病毒复制的效果。关键词：FMDV；整联蛋白β6亚基；RNAi；G418；猪胚胎成纤维细胞；BHK细胞IIIIVAbstractObject:Integrinisacellreceptorsmediatedvirusinvadeshostcells