htert基因转染大鼠雪旺细胞的实验研究

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1、中图分类号密级hTERT基因转染大鼠雪旺细胞的实验研究ExperimentalstudyofhTERTgenetrasfection—inducedimmortalizationofSchwanncellsotrat。‘‘⋯‘‘n计：学位论文：37页表格：3个插图：5幅莫霄指导教师：曲巍教授申请学位级别：硕士学位学科(专业)：外科学培养单位：大连医科大学附属第一医院完成时间：二O一三年四月答辩委员会主席：大连医科，～‘掌颂i学位论支独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特另

2、lJ)jrl以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：豳签字日期：上丛年』月三日附件2：关于学位论文使用授权的说明本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描

3、等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于(请在以下相应方框内打“√”)：1．保密口，在一年解密后适用本授权书。2．不保密口。作者签名：导师签名：日期：年月日日期：年月日目录一、摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1(一)中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1(二)英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3二、正文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5(一)前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5(二)材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61．实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．．⋯

4、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61．1组织来源⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61．2主要药品与试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61．3主要仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯72．实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯82．1雪旺细胞的原代分离培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯82．2脂质体法hTERT转染雪旺细胞⋯⋯⋯⋯⋯92．3实验分组⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯92．4免疫荧光⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯92．5荧光定量PCR⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯102．6WesternBlot······················

5、·······················132．7统计学分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯16(三)结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯161．原代雪旺细胞的形态学观察及鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯162．hTERT基因转染后的雪旺细胞⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯173．免疫荧光鉴定转染后雪旺细胞⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯174．荧光定量PCR检测转染后雪旺细胞分泌蛋白mRNA⋯⋯185．WesternBloting检测转染后雪旺细胞分泌蛋白的表达⋯⋯19(四)讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯19(五)结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

6、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯23(六)参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯24三、文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯26(一)综述正文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯26(二)参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯33四、致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯37大连医科大学硕士学位论文hTERT基因转染大鼠雪旺细胞的实验研究硕士生姓名：莫霄指导教师：曲巍教授专业名称：外科学摘要目的：雪旺细胞作为周围神经工程中的核心种子细胞，在神经修复。再生等方面发挥重要作用，而体外培养的雪旺细胞，常因多次连

7、续传代后衰老而凋亡，最终死亡。永生化雪旺细胞具有无限传代的功能，可解决雪旺细胞在组织工程中应用的难题。本实验通过hTERT基因转染大鼠雪旺细胞以期得到永生化细胞。方法：1．选取出生后7天左右的SD大鼠，冰冻处死后酒精浸泡消毒，取其坐骨神经以及臂丛神经，剪碎至1mm3大小的组织块，双酶消化法进行体外分离培养，待细胞生长到85％汇合密度时用低浓度胰酶快速消化传代，30分钟差速贴壁法进一步纯化雪旺细胞，用光学显微镜进行形态学观察并拍照。经S100免疫荧光鉴是否为雪旺细胞。2．将纯化的雪旺细胞用含hTERT基因的质粒经脂质体转染法转染原代雪旺细

8、胞，用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养细胞，待细胞生长满80％密度时更换含G418(100ug／m1)的完全培养基，每3天换液1次，筛选2周，转入含hTERT基因的质粒的细胞经过筛选获得阳性克隆后继续