淡足侧沟茧蜂气味结合蛋白的原核表达及结合特性研究.pdf

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1、学校代码：10264研究生学号：M150110167上海海洋大学硕士学位论文题目：淡足侧沟茧蜂气味结合蛋白的原核表达及结合特性研究英文题目：AnalysisofProkaryoticExpressionandBindingCharactersofOdorantBindingProteinsinMicroplitispallidipes专业：生物学研究方向：昆虫分子生物学姓名：杨安指导教师：蒋杰贤二O一八年五月二十四上海海洋大学博/硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注李家乐上海海洋大学教授主席张德福上海市农业科学院

2、研究员委员李震上海市农业科学院研究员委员刘惠莉上海市农业科学院研究员委员郑洪建上海市农业科学院研究员委员范晓芬上海市农业科学院助理研究员秘书上海农科院华漕院区答辩地点答辩日期2018.05.25机关大楼二楼会议室本研究得到以下项目资助：1、国家自然科学基金：淡足侧沟茧蜂识别感染核型多角体病毒甜菜夜蛾的嗅觉分子机理（编号31601641）2、上海市科技兴农重点基础研究：天敌昆虫与杆状病毒协同防控蔬菜害虫的效应及机理研究[沪农科攻字(2014)第7-3-2号]淡足侧沟茧蜂气味结合蛋白的原核表达及结合特性研究摘要淡足侧沟茧蜂Micr

3、oplitispallidipesSzepligeti是一种重要的害虫天敌，主要寄生夜蛾科害虫里的中低龄幼虫。本研究针对得到的淡足侧沟茧蜂气味结合蛋白MpOBP8和MpOBP10，运用相关生物信息学软件对它们与其他物种的气味结合蛋白进行了序列相似性比对及亲缘关系推断。并成功构建了pET28a(+)-MpOBP8、pET32a(+)-MpOBP8、pET28a(+)-MpOBP10及pET32a(+)-MpOBP10原核表达载体，通过对MpOBP8原核表达条件的优化调整，探索出了它的最优表达条件，获得了含量较高的该气味结合蛋白；

4、对MpOBP10基因进行了原核表达研究。为后期研究MpOBP8和MpOBP10的对化学物质的识别分子机理夯实了基础。主要结果如下：1.淡足侧沟茧蜂MpOBP8与膜翅目昆虫中红侧沟茧蜂MmOBP8的亲缘关系最近。MpOBP10与毁侧沟茧蜂Microplitisdemolitor的MdOBP72的进化关系最近，其次是中红侧沟茧蜂的MmOBP10。MpOBP8和MpOBP10与直翅目、鳞翅目、双翅目、鞘翅目昆虫的进化亲缘关系依次变远，两者均与鞘翅目昆虫赤拟谷盗Triboliumcastaneum的OBP13亲缘关系最远。2.通过Ba

5、mHⅠ和HindⅢ这两种酶进行双酶切的方法构建了pET28a(+)-MpOBP8、pET32a(+)-MpOBP8、pET28a(+)-MpOBP10及pET32a(+)-MpOBP10原核表达载体。通过SDS-PAGE检测，pET28a(+)-MpOBP8、pET28a(+)-MpOBP10均未出现相应大小的目的蛋白条带。而pET32a(+)-MpOBP8、pET32a(+)-MpOBP10均出现了相应大小的目的蛋白条带。pET32a(+)-MpOBP8表达出的目的蛋白条带在上清和沉淀中均存在，且通过原核表达条件的优化，以可

6、溶性形式存在于上清中的目的蛋白含量与存在于沉淀中的目的蛋白含量基本一致。而pET32a(+)-MpOBP10原核表达载体表达出的目的蛋白条带，结1果显示其以包涵体的形式大量存在于沉淀中。但存在于上清中的可溶性目的蛋白量几乎为零。3.通过不同的诱导温度25℃、28℃、31℃、34℃、37℃，不同的诱导时间1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h和9h，不同IPTG诱导浓度分别是0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.7mM、0.9mM、1.0mM，不同诱导时机菌体OD600值分别约为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、

7、0.6、0.7、0.8，来展开优化表达条件的试验。pET32a(+)-MpOBP8原核表达条件的优化显示：最佳诱导温度、诱导时间、诱导时机、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）的终浓度分别为25℃、6h、菌体培养液OD600为0.1～0.3和0.1mmol/L。4.昆虫气味结合蛋白能辨识、结合不同的挥发性气味分子。不同化学物质与荧光探针氮-苯基-1-萘胺1-NPN可竞争性结合纯化后的重组气味结合蛋白MpOBP8。重组MpOBP8与不同浓度的1-NPN的结合，直至两者的结合反应程度达到饱和的状态。运用GraphPadPris

8、m5软件计算得出了MpOBP8与1-NPN的结合常数K1-NPN约为12.68。并绘制出了氮-苯基-1-萘胺1-NPN的浓度与相对荧光值的相关曲线及斯卡査德Scatchard线性化作图。通过重组气味结合蛋白MpOBP8与37种不同气味分子的结合试验，探索了不同配基气味分子与M