高效液相色谱知识分享

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1、高效液相色谱知识分享 总述：根据样品在流动相和固定相中的分配系数的不同将组分分离开来，依次通过紫外检测器检测，再通过色谱工作站输出色谱流出曲线，依据色谱流出曲线我们可以得到：“色谱峰个数——组分最少个数；保留值——定性分析；面积、峰高——定量分析；保留值、区域宽度——判断色谱柱的分离效能；两峰间的距离——评价固定相、流动相的选择及配比是否合适”等信息。下面从以下几方面进行阐述（原理、设备、注意事项）：I．概论一、液相色谱理论发展简况1、色谱法的诞生色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906

2、年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。2、HPLC的特点和优点2.1HPLC有以下特点：高压-压力可达150~300Kg/cm2。色谱柱每米降压为75Kg/cm2以上。高速-流速为0.1~10.0ml/min。高效-可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。高灵敏度-紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。2.2HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：速度快-通常分析一个

3、样品在15~30min，有些样品甚至在5min内即可完成。分辨率高-可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。灵敏度高-紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。柱子可反复使用-用一根色谱柱可分离不同的化合物。样品量少，容易回收-样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobilephase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationaryphase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同

4、，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。二、基本概念和术语1．色谱图和峰参数141.1色谱图(chromatogram)--样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elutionprofile)。1.2基线(baseline)--经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。1.3噪音(noise)--基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。1.4漂移(drift)--基线随时间

5、的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。1.5色谱峰(peak)--组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰(leadingpeak)和拖尾峰(tailingpeak)。前者少见。1.6峰高(peakheight，h)-峰的最高点至峰底的距离。1.7峰底-基线上峰的起点至终点的距离。1.8峰宽（peakwidth，W)-峰

6、两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W＝4σ；它由组分在色谱柱中性质和扩散行为决定，即色谱过程动力学决定。1.9半峰宽（peakwidthathalf-height，Wh/2)-峰高一半处的峰宽。Wh/2＝2.355σ。1.10标准偏差（standarddeviation，σ)-正态分布曲线x＝±1时（拐点）的峰宽之半。正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。σ小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。1.11峰面积

7、(peakarea，A)-峰与峰底所包围的面积。2．定性参数（保留值）死时间(deadtime，t0)--不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。死体积(deadvolume，V0)--由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有Vm参与色谱平衡过程，其它3部分只起峰扩展作用。为防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小。V0＝F×t0（F为流速）保留时间(retent

8、iontime，tR)--从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。保留体积(retentionvolume，VR)--从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。VR＝F×tR14调整保留时间(adjustedretentiontime，t'R)--扣除死时间后的保留时间。也称折合保留时间(reducedretentiontime)。在实验条件（温度、固定相等）一定时，t'R只决定于组分的性质