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1、畜牧兽医学报,1998,29(5),385-391ActaVeterinariaetZootechnicaSinica二花脸猪和杜洛克猪的RAPD分析周俊玲 彭中镇 李 奎 赵书红 龚炎长 熊统安 刘平华(华中农业大学,武汉 430070)陈永久 张亚平罗 明 黄路生(中科院昆明动物研究所,昆明 650223)(江西农业大学,南昌 330045)摘 要 利用60个随机引物对二花脸猪(太湖猪的一个类群)和杜洛克猪的基因组DNA进行RAPD分析,其中48个引物可扩增出清晰的RAPD带型,8个引物可扩增出多型性片段。一个引物(OPB13)可在两品种间扩增出一条稳定的重复性好的多
2、态片段,其大小约为1890bp。结果表明,二花脸猪、杜洛克猪群内遗传距离指数分别为010371、010345,遗传多样性指数分别为01486、01431,两品种间存在着DNA分子水平上的差异;利用RAPD技术可以快速有效地检测猪的DNA多态性,RAPD技术在猪基因组研究中有广阔的应用前景。关键词 二花脸猪,杜洛克猪,RAPD,遗传差异X1990年,Williams和Welsh领导的两个实验小组同时独立地发展起来一项新的DNA多[1、2]态性检测技术,即随机扩增多态DNA(RandomAmplifiedPolymorphicDNA,RAPD)。该技术利用一系列不同的碱基顺序
3、随机排列的寡聚核苷酸单链(通常为十聚体)为引物,对所研究的基因组DNA进行PCR扩增。扩增产物通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离,经[3]溴化乙淀(EB)染色或银染可检测出DNA的多态性。RAPD具有以下特点:(1)无需预先知道所研究基因组DNA的序列,因而能应用于所有的生物体;(2)绝大多数RAPD标记为孟德尔遗传;(3)不同生物基因组可共用一套引物;(4)无需借助于有伤害性的同位素,只需极少量的基因组DNA,分析简便、快速、灵敏。RAPD技术自问世以来,在生物遗传变异研究、基因定位、动植物遗传连锁图谱构建、特定基因的鉴定和分离等方面表现了极大的实用价值。本文尝试应
4、用RAPD技术检测我国地方优良猪种太湖猪的一个类群——二花脸猪与美国猪种杜洛克猪的DNA多态性,以期从DNA分子水平上分析这两个品种猪的遗传差异,并评价RAPD在猪基因组研究中的应用前景。1 材料与方法111 材料 本实验取材于37头二花脸猪和34头杜洛克猪的基因组DNA。X博士点基金、湖北省自然科学基金和江西省重点课题资助项目。33本研究得到魏庆信研究员、郑新民副研究员、任广志教授、张建生、孙士铨、郑传玲、代广军、钱利增、蔡三元、王寿宽等同志的大力帮助,在此一并致谢。333收稿日期 1997201223。©1994-2007ChinaAcademicJournalEle
5、ctronicPublishingHouse.Allrightsreserved.http://www.cnki.net5期周俊玲等:二花脸猪和杜洛克猪的RAPD分析393112 基因组DNA的提取 采用本实验室建立的从固定的猪白细胞中提取DNA的方法提取[4]基因组DNA。详见参考文献。113RAPD反应 用60个10碱基随机引物(美国OPERON公司产品,包括F组、B组全部引物及A、D、H组部分引物)对供试猪基因组DNA进行PCR扩增,并用筛选出的具有多态性或特异性强的4个引物(F15、F16、F17、B13)对所有供试猪基因组DNA进行重复扩增,以验证结果的可靠性并
6、考察这两个类群的遗传变异。RAPD反应采用中科院昆明动物研究所细胞与分子进化开放实验室建立的RAPD反应体系及扩增条件。反应总体积为10Ll,包括10mmolöLTris2Cl,pH910,50mmolöLKCl,215mmolöLMgCl2,011mmolöL的每种dNTP,10Lgöml的BSA(牛血清白蛋白,DNA聚合酶稳定剂),012LmolöL的随机引物,1UTaqDNA聚合酶(华美生物工程公司),15ng左右模板DNA及去离子水,反应混合物用20Ll石蜡油覆盖。每个反应为40个循环,每个循环包括94℃变性1min,36℃退火1min,72℃延伸2min。首次循
7、环前先在95℃预变性3min20s,最后一个循环后在72℃延伸5min,并且每次PCR反应均设置不含模板DNA的空白对照。反应在美国STRATAGENE公司的RobocyclerGradi2ent40型DNA扩增仪上进行。扩增产物经114%的琼脂糖(上海东海制药厂产品)凝胶电泳分离,溴化乙淀染色后于紫外灯(上海顾村电光仪器厂产品)下观察拍照,或者直接在STRATA2GENE公司的EagleEyesÊ自动成像仪上成像取照。114 数据处理11411 只记录那些电泳后条带清晰的RAPD标记:任意两个体间的遗传变异用遗传距离指数D(
