秦巴山区三尖杉内生真菌活性代谢产物研究

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1、分类号：Q939.92单位代码：10720密级：公开学号：1107100104硕士学位论文秦巴山区三尖杉内生真菌活性代谢产物研究StudyonactivemetabolitesofendophyticfungusfromCephalotaxusfortuneiinQin-Bamountainareas论文作者：刘兆迪指导教师、职称：陈文强教授学科、专业名称：植物学研究方向：植物生物技术二〇一四年五月ii陕西理工学院学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，论文中不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果，也

2、不包含为获得陕西理工学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意。作者签名：年月日陕西理工学院学位论文使用授权声明本人同意研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属陕西理工学院。本人保证毕业离校后，发表本论文或使用本论文成果时署名单位仍为陕西理工学院。学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其它指定机构送交论文的电子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆、院系资料室被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。本学位论文属于1、保密□，在__

3、____年解密后适用本授权书。2、不保密□。（请在以上相应方框内打“√”）作者签名：年月日摘要三尖杉（Cephalotaxusfortunei）作为国家二级保护珍稀濒危药用植物，其消炎、抗肿瘤、杀菌、润肺止咳等多种功效在中国古代已有记载，而现代人们对三尖杉的深入研究可追溯到1971年，到现今已提取分离到几十种生物碱，比如已用作临床治疗急性白血病和部分实体瘤的三尖杉酯碱（HT）和高三尖杉酯碱（HHT）。然而出于对珍稀植物资源保护和生态平衡的考虑，传统的提取工艺已逐渐被替代，利用微生物发酵方法来生产某些具药用价值的活性成分，已表现出越来越广阔的应用前景。植物内生真菌是一个巨大的资源宝库，不同生长

4、环境下的植物内生真菌及其产生的次生代谢产物也将有所不同，这将为寻找更有价值的药用成分提供可能。本研究所用内生真菌皆分离自秦巴山区野生三尖杉根部，通过滤纸片扩散法和MTT法对全部供试三尖杉内生真菌的发酵液进行抑菌和细胞毒活性测试，选择活性较好的菌株进行大量发酵，之后用等量乙酸乙酯萃取发酵液上清并浓缩蒸干，再通过硅胶柱层析对提取物进行粗分，对分离得到的各组分进行活性追踪测试，选取活性集中部位进行GC-MS检测并分析，寻找有价值的化学成分。以下为本课题之实验方法和结果：1.内生真菌的筛选：采用滤纸片扩散法和MTT法对10株三尖杉内生真菌发酵液进行抑菌和细胞毒活性测试。结果表明，10株内生真菌对人急

5、性早幼粒白血病细胞（humanpromyelocyticleukemiacell）HL-60和至少两种指示菌具有拮抗作用。其中菌株CEP18活性较好，对HL-60细胞的生长抑制率为41.41%，对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果好，抑菌圈直径分别为22mm和20mm，对沙门氏菌的抑菌效果较好，抑菌圈直径为9mm。2.目标菌株次生代谢产物的萃取和分离：将菌株CEP18发酵50L，得到乙酸乙酯提取物10.2g，经硅胶柱层析对其粗分，得到5个组分：Fr1(105.0mg)、Fr2(387.0mg)、Fr3(29.0mg)、Fr4(16.0mg)、Fr5(22.0mg)。3.各组分的活性追踪测

6、试：用滤纸片扩散法和MTT法对浓度为1.0mg/ml的五个组分做抑菌和细胞毒活性测试，结果组分Fr2对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的生长具有较明显的抑制作用，抑菌圈直径分别达23.0mm和26.0mm，对沙门氏菌的活性较弱，而对大肠杆菌和白色念珠菌则无抑制活性。其它组分对指示菌株均无明显抑制活性。细i胞毒活性测试结果显示，组分Fr2对HL-60显示出了较明显的抑制作用，抑制率为50.65%，进一步检测得IC50值为8.721μg/ml。组分Fr1的细胞毒活性较弱，抑制率为22.51%，而其它组分则没有表现出明显的细胞毒活性。由此，菌株CEP18发酵液的乙酸乙酯提取物的抑菌和细胞毒活性成分较好

7、的集中在组分Fr2中，将Fr2作为目标组分进行下一步研究。4.目标组分的GC-MS检测分析：将目标组分Fr2（30.0mg）溶于甲醇，经滤纸过滤后做GC-MS分析，结果样品中共检出27种成分，经多重比对鉴定了其中18种化学成分，占总量的94.37%。其主要成分为对羟基苯乙酸（8.27%）、反油酸甲酯（10.07%）、棕榈酸（7.54%）等。其中对羟基苯乙酸在三尖杉属植物的相关研究中属首次发现并报道。关键词：三