Ⅰ群禽腺病毒的分离、精制卵黄抗体的初步制备及全病毒ELISA试剂盒的研制

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1、分类号密级UDC单位代码硕士专业学位论文Ⅰ群禽腺病毒的分离、精制卵黄抗体的初步制备及全病毒ELISA试剂盒的研制IsolationofGroupIFowlAdenovirus,PreparationofpurifiedYolkAntibodyandDevelopmentofWholeVirusELISAKit研究生姓名矫海婷指导教师张灿副教授第二导师吴延功研究员学位种类兽医硕士2018年4月QingdaoAgriculturalUniversityTheThesisofProfessionalM

2、asterIsolationofGroupIFowlAdenovirus,PreparationofpurifiedYolkAntibodyandDevelopmentofWholeVirusELISAKitGraduatewithProfessionalMasterDegree：Mentor:ZhangCanAssociateProfessorSecondMentor:WuYangongResearcherTypeofProfessionalDegree：MasterofVeterinaryM

3、edicineAcademicfield：独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得青岛农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年月日关于论文使用授权的说明本人完全了解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁

4、盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日青岛农业大学硕士专业学位论文摘要Ⅰ群禽腺病毒的分离、精制卵黄抗体的初步制备及全病毒ELISA试剂盒的研制摘要Ⅰ群禽腺病毒（FAVⅠ）可引起包涵体肝炎、心包积液等主要病理变化，为条件致病性病毒。由该病毒引起的疾病在国内外均有发生。本试验从山东、黑龙江、吉林等地

5、区发病鸡的肝脏中检测、分离到10株Ⅰ群禽腺病毒，选取一株毒力强的流行血清型8b毒株SDQD161224制备灭活苗并免疫，测定血清中抗体的消长水平并制备精制卵黄抗体，为Ⅰ群禽腺病毒病的防治提供了基础。具体内容包括以下三个方面：（1）禽腺病毒的分离鉴定与同源性分析。利用PCR方法从山东、黑龙江、吉林等各地发病鸡的肝脏内检测到10株Ⅰ群禽腺病毒，用鸡肝癌细胞株（LMH）进行病毒的分离和培养，测序及同源性分析。同源性比对结果显示，10株Ⅰ群禽腺病毒中，1株为血清4型，5株为血清8b型，4株为血清11型。

6、（2）禽腺病毒抗体水平消长规律的研究。将SDQD161224毒株接种LMH细胞。纯化浓缩后的病毒液进行TCID-4.450的测定，滴度为10/100µl。病毒用甲醛灭活，与弗氏佐剂制成灭活苗，免疫120日龄海兰褐商品蛋鸡，免疫三次，间隔2周。免疫后每3d采血一次，细胞中和试验测定血清PD50。首次免疫后未测得血清抗体；于第二次免疫后第6d开始可检测到血清抗体，测得的血清中抗体的PD-1.11850分别是10/50µl、10-1.614/50µl、10-2.116/50µl、10-2.4/50µl

7、；第三次免疫后测得的血清抗体PD50分别为10-2.354/50µl、10-2.228/50µl、10-2.194/50µl、10-1.981/50µl、10-1.886/50µl。由此可知，抗体消长的一般规律是先较快增长到一定水平，后保持相对稳定。（3）精制卵黄抗体的制备。于免疫后收集鸡蛋，制备精制卵黄抗体。通过对制备流程各条件的优化，确定按1:6稀释、pH5.4、放置6h时，卵黄抗体除脂率最高，达97.36%；离心条件为4000r/min离心20min，卵黄抗体除脂率最高，达95.83%；辛

8、酸浓度为2%时，溶液易于分层，滤液澄清；甲醛灭活浓度为2‰时，鸡胚不致死、无菌落生长。（4）全病毒ELISA方法的建立。以制备的精制卵黄抗体为抗体，以纯化青岛农业大学硕士专业学位论文摘要SDQD161224毒株（血清型8b）为包被抗原，建立Ⅰ群禽腺病毒ELISA检测方法。通过对各条件的优化，确定病毒抗原的最佳包被稀释度为1：2000，卵黄抗体最佳稀释度为1:200，阳性卵黄抗体OD450nm值（P）为1.239，阴性抗体OD450nm值（N）为0.441时，P/N最大值为2.810。特异性、敏感