hwnk4基因3%27非翻译区及mir-296对基因表达调控作用机制的研究

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1、·中文论著摘要·hWNK4基因3，非翻译区及miR．296对基因表达调控的作用机制研究．▲上．-J一刖吾WNK4(with-no-lysinekinase-4)是新近克隆的一种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶的编码基因，该基因第7外显子和第17外显子错义突变可导致常染色体显性遗传疾病．II型假性低醛固酮血症(PseudohypoaldosteronismtypeII，PHAII)，主要表现为高血压和高血钾。研究表明WNK4主要作用于肾脏远曲小管和集合管上的多个离子转运体和离子通道，比如Na--CI共转运体(Na-CICO．transporter，NCCT)、髓外钾离子通道(RenalOuterMedu

2、llaryPotassiumchannel，ROMK)、上皮钠通道(EpithelialSodiumChannel，ENaC)，从而起到对体液离子平衡和血压的调控作用。目前大量的研究集中在WNK4的功能上，而WNK4基因调控机制仍不清楚。基因组包含编码序列和非编码序列，其中编码序列在人类基因组中所占比例不到5％，非编码序列超过95％。过去很长一段时间内认为这些非编码序列是“垃圾DNA(junkDNA)”，现在人们逐渐认识到这些非编码序列对基因的表达发挥着重要的调控作用，尤其是基因的5’和3’侧翼的非编码区。本研究组前期对hWNK4基因的5馆动子区进行了研究，发现h瓣的启动子并不含有TATA盒

3、，它包含多个潜在的转录因子结合位点，比如Spl、GR、GATA．1、APl、AP2、NF．1出和C／EBPa等。李春义等证实在启动子区的．285和．337位存在两个糖皮质激素反应元件(glueocortieoidresponseelement，GRE)，地塞米松(dexamethasone，Dex)可通过这两个GRE抑制h删的转录活性。李苗等发现在启动子区的．426位存在一个GATA-1反应元件，应用组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(trichostatinA，TSA)可以增JJLIGATA-I的乙酰化，增强其与反应元件的亲和力，从而影响启动子的活性，上调hWNK4的表达。这些关于hWNK

4、4基因的5’启动子的表达调控研究对阐明高血压的发病机制有重要意义；然而，hWNK4基因的3’非翻译区(3’-untranslatedregion，3'-UTR)的调控作用迄今未见报道。微t．bRNA(microRNA，miRNA)是近年来生物学研究的一个热点，是一类长度约19～25nt内源性单链非编码RNA分子。研究表明miRNA通过调控基因表达参与了生命中的一系列重要过程，包括早期发育、细胞分化、细胞增殖、细胞凋亡以及细胞死亡等。大部分实验证明动物miRNA通过与靶基因mRNA的3’．UTR不完全配对结合，在转录后水平负调控基因表达。因此，本研究拟重点探讨hlJ"NK4基因3'-UTR的作

5、用和功能。通过生物信息学、报告基因载体构建、real．timePCR、WesternBlot等实验技术验证hB,'NK43'-UTR的作用以及其上的潜在miRNA结合位点，从而探讨hWNK43'-UTR参与基因表达调控的机制。材料与方法在萤光素酶报告基因载体pGL3．Basic基础上，利用基因重组技术构建多种质粒，包括pSV40·luc、pSV40一luc—UTR、p484-luc、p484一luc—UTR、p337-luc、p337一Iuc-UTR、p216-1uc、p216一luc-UTR。利用Lipofectamine2000分别转染人胚肾细胞系HEK293、人胃腺癌细胞系BGC823

6、和人宫颈腺癌细胞系Hela，应用DUAL．GLOTM双荧光素酶检测系统检测荧光素酶的活性。应用染色体构象捕获技术观察hWNK4Y-UTR与启动子的远隔交互作用。利用生物信息学软件对hWNK4基因3'-UTR进行miRNA靶向预测。在pcDNA3．1(+)基础上构建miR-296的表达载体pmiR-296，并购买了miR．296的抑制剂(Ambion)。利用瞬时转染技术过表达miR．296或抑制miR-296表达，通过萤光素酶报告基因、Real．timePCR及Western印迹杂交等实验进行验证。结果1、通过UCSCGenomeBioinformatic(http：／／genome．UCSC

7、．edu／)对多个哺乳动物的比较，tYNK4序列具有高度保守性，其Y-UTR区一致性达95％。2、在HEK293、BGC823和Hela中分别转入pSV40．1ue或pSV40．1uc．UTR，发现hWNK43’-I凰具有增强子作用，将异源SV40启动子换为同源的484-bp启动子后增强子作用仍存在，但是在各细胞中的作用强度不一致。3、应用染色体构象捕获技术观察到hWNK4启动子和Y-UTR之间存在远隔交互作