布鲁氏菌omp25基因缺失株的构建及对细胞自噬的影响

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1、分类号：密级：请注明密级及保密期限学号：2010108020单位代码：10759石河子大学硕士学位论文布鲁氏菌omp25基因缺失株的构建及对细胞自噬的影响学位申请人陈瑞花陈创夫教授指导教师张辉副教授申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称基础兽医学研究方向动物疾病病理学所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2013年5月ConstructionofBrucella△omp25strainandit’svirulenceevaluationADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPa

2、rtialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureByChenRuihua(PreventiveVeterinaryMedicine)DissertationSupervisor:Prof.ChenChuang-fuAssociateProf.ZhanghuiMay,2013课题来源973计划项目项目名称：布鲁氏菌侵染与胞内寄生的分子机制研究项目编号：2010CB530203国家自然科学基金项目项目名称：布鲁氏菌侵染胚胎滋养层细胞过程中关键分子

3、的功能研究项目编号：31001046国家自然基金项目名称：与nrdp1和socs-1互作的布鲁氏菌蛋白的筛选及其作用的分子机制研究项目编号：31260596中文摘要布鲁氏菌病是一种人畜共患的慢性传染病，动物感染该病后的表现为母畜的流产和公畜的睾丸炎，对人而言，感染该病后可引起人的波浪热，关节炎以及肌肉疼痛等。布鲁氏菌（Brucella）作为布鲁氏菌病的病原菌，其在宿主内的生存机制一直都是研究的热点。布鲁氏菌本身不产生内毒素，其逃避宿主的免疫系统的杀伤作用主要是通过各种毒力因子实现的，外膜蛋白就是布鲁氏菌的重要毒力因子之一，因

4、此本文从布鲁氏菌的外膜蛋白基因omp25基因入手，通过以下三个实验在细胞水平和个体水平上探讨布鲁氏菌在侵袭宿主时，omp25基因缺失株的毒力和对细胞自噬的影响。1根据GenBank中发表的布鲁氏菌外膜蛋白基因omp25的基因序列，设计一对引物，通过PCR方法扩增omp25基因的DNA片段，将扩增片段克隆至T载体中，构建克隆载体pMD-T-omp25，经PCR筛选出阳性克隆菌并测序鉴定，分别将pET28a-GFP质粒和测序成功的pMD-T-omp25质粒用限制性内切酶EcoRⅠ、SalⅠ双酶切，并将回收的omp25基因片段、p

5、ET28a-GFP片段进行连接，构建原核表达载体pET28a-GFP-omp25，将表达载体转化至表达菌E.coliBL21(DE3)中，并纯化出带有绿色荧光的OMP25蛋白，进行Westernblot分析可知，OMP25蛋白具有良好的反应原性。2根据GenBank中发表的布鲁氏菌omp25基因序列的上下游基因序列设计两对上下臂引物，通过PCR方法分别扩增上下臂基因序列，然后用融合PCR的方法将回收的上下游基因片段融合并扩增。以枯草芽孢杆菌的SacB基因设计特异性引物并扩增SacB基因序列。然后将融合片段与SacB基因序列分

6、别连接到克隆载体pMD19-Tsimple上，上下游融合片段经XholI与SacI双酶切后连接至自杀载体pGEM-7zf+上，得到pGEM-7zf-∆omp25自杀载体，再将SacB基因经SacI单酶切连接到带目的基因的自杀载体中，获得pGEM-7zf-∆omp25-SacB自杀质粒，将自杀质粒电转化至布鲁氏菌2308感受态细胞，经过在细菌内部同源重组后，分别经100mg/L氨苄抗性筛选和8%蔗糖敏感性筛选，获得omp25基因突变株，突变株在无抗性布鲁氏菌培养基上传15代，成功获得遗传稳定的2308∆omp25株。用2308

7、∆omp25侵染人胚胎滋养层细胞（HPT-8），进行胞内细菌CFU计数，在细胞水平上对2308∆omp25进行毒力评价；用2308∆omp25感染小鼠，进行小鼠脾脏CFU计数，在个体水平上对2308∆omp25进行毒力评价，发现缺失株的毒力介于强毒株2308与疫苗株RB51之间。3分别用基因缺失株2308∆omp25、流产布鲁氏菌（B.abortus）强毒株2308，以及疫苗株RB51侵染胚胎滋养层细胞HPT-8，选用兔抗人LC3一抗、兔抗人Beclin1一抗和羊抗兔IgG荧光二抗，用免疫组织化学方法制备细胞免疫荧光切片，通

8、过激光共聚焦显微镜观察细胞免疫荧光切片，记录各个细胞免疫荧光I切片的平均荧光强度，分析各菌株对细胞自噬的作用程度，同时在各菌株侵染胚胎滋养层细胞HPT-8后，提取细胞总RNA，反转录得到cDNA，以cDNA为模板，运用实时定量PCR方法，检测细胞内的自噬相关基因LC3和Beclin1的表达