绵羊无浆体和牛无浆体实时荧光定量pcr检测方法的建立

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1、分类号：S854.43学校代码：10758密级：公开学号：1032020239硕士学位论文绵羊无浆体和牛无浆体实时荧光定量PCR检测方法的建立DevelopmentofReal-timeQuantitativePCRsfordetectionAnaplasmaovisandA.bovis研究生姓名迟庆安导师姓名及职称殷宏研究员合作导师姓名及职称岳城教授学位门类级别农学硕士专业名称预防兽医学研究方向人畜共患病与兽医公共卫生学所在学院动物医学学院新疆·乌鲁木齐二○一三年六月独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我

2、所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得新疆农业大学或其他教育单位的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年月日关于学位论文使用授权的说明本人完全了解新疆农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：新疆农业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，允许论文被查阅和借阅。本人授权新疆农业大学将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，

3、可以公布（包括刊登）论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日绵羊无浆体和牛无浆体实时荧光定量PCR检测方法的建立摘要无浆体（Anaplasma）是一类经蜱传播的专性细胞内寄生菌，主要寄生于牛羊等反刍动物的血细胞中，其引起的疾病被称为无浆体病。已知的无浆体病原包括边缘无浆体（A.marginale）、绵羊无浆体（A.ovis）、中央无浆体（A.centrale）、牛无浆体（A.bovis）、嗜吞噬细胞无浆体（A.phagocytophilum）和扁平无浆体（A.platys）。建立高效快速准

4、确的诊断方法，对于该病的防控具有重要作用。实时荧光定量PCR技术具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、自动化程度高、速度快、全封闭反应等优点，使其很快成为疾病检测和诊断的热点技术。目前，国内外均未有检测绵羊无浆体和牛无浆体实时荧光定量PCR方法的报道。利用实验室保存的12株绵羊无浆体的gltA基因进行克隆测序。然后根据获得的绵羊无浆体和GenBank上其他相近病原体的gltA基因序列设计出针对绵羊无浆体的实时荧光定量引物和探针，建立了一种检测绵羊无浆体的实时荧光定量PCR方法。该方法特异性强，与相近病原如边缘无浆体、牛无浆体、嗜吞噬细胞无浆体、支原

5、体、衣原体、螺旋体、巴贝斯虫（新疆分离株）和吕氏泰勒虫无交叉反应。检测灵敏度约10拷贝/μL。该方法具有较好的稳定性，组内试验和组间试验Ct值变异系数分别在在0.26％-0.97％和0.42%-1.5%。对野外采集的254份山羊血液样品分别使用该方法和普通PCR方法进行检测，阳性率分别为25.6%和9.06%，结果表明实时荧光定量PCR方法具有更高的敏感性。建立的绵羊无浆体实时荧光定量PCR方法可以有效检测绵羊无浆体感染。根据GenBank上牛无浆体及其他相近病原体16SrRNA基因序列设计出针对牛无浆体的实时荧光定量引物和探针，建立了一种检测牛无浆体实

6、时荧光定量PCR方法。该方法特异性好，与相近病原如边缘无浆体、绵羊无浆体、嗜吞噬细胞无浆体、绵羊泰勒虫、吕氏泰勒虫、中华泰勒虫、巴贝斯虫（新疆分离株）、牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、支原体、衣原体、螺旋体和弓形虫无交叉反应。检测灵敏度约10拷贝/μL。该方法稳定性好，组内试验和组间试验Ct值变异系数分别在0.10%-1.01%和0.61%-1.88%，对野外采集的196份牛和山羊血液样品分别使用实时荧光定量PCR方法和套式PCR方法进行检测，阳性率分别为62.2%和56.6%，结果表明实时荧光定量PCR方法具有更高的敏感性。建立的牛无浆体实时荧光定量PCR方

7、法可以有效检测牛无浆体感染。关键词：绵羊无浆体；牛无浆体；实时荧光定量PCR；检测IDevelopmentofReal-timeQuantitativePCRsfordetectionAnaplasmaovisandA.bovisAbstractAnaplasmaisatick-borneendoglobularrickettsialpathogenofruminants,whichcausediseasearecalledAnaplasmosis.TheknownpathogenesincludeA.marginale,A.ovis,A.central

8、e,A.bovis,A.phagocytophilumandA.platys.T