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1、第41卷第6期厦门大学学报(自然科学版)Vol.41No.62002年11月JournalofXiamenUniversity(NaturalScience)Nov.2002文章编号:043820479(2002)06208042064种裸子植物内生真菌抗肿瘤菌株的筛选张永杰,王建锋,黄耀坚,郑忠辉,苏文金(厦门大学生命科学学院生物学系,福建厦门361005)摘要:使用组织块法,从罗汉松、南方红豆杉、三尖杉及银杏中分离到112株植物内生真菌;为得到高活性抗肿瘤菌株,我们使用卤虫(ArtemiaSailina)模
2、型进行初筛,得到39株(LD50>8)高活性菌株(占总分离菌株的34.8%),利用MTT法对具有杀卤虫活性的菌株进行复筛,结果显示9株菌株(占总分离菌株的8.0%),对KB或HL260细胞具有显著的抑制作用(ID50为80～7290).罗汉松、南方红豆杉、三尖杉内生真菌的抗肿瘤活性菌株分别占各分离菌株的7.4%、11.1%、8.3%,这显示了药用裸子植物内生真菌在抗肿瘤生物活性物质的研究与应用中具有重要的价值.作者还对抗肿瘤筛选的卤虫模型和MTT模型组合应用进行了有益的探讨.关键词:植物内生真菌;筛选;卤虫;M
3、TT法;抗肿瘤中图分类号:Q939.93文献标识码:A[8]植物内生真菌是指存在于健康植物的茎叶中,瘤等多种药理活性的报道.本工作以上述4种裸[1]不形成明显病症的真菌.有关植物内生真菌的研子植物为材料,系统地进行内生真菌的分离鉴定和究起始于19世纪末,国内对内生真菌的研究则刚刚抗肿瘤活性菌株的筛选工作,以期获得具有较高研起步.至90年代中期,研究内容多局限于一些植物究价值的菌株.现将研究结果报道如下.感染内生真菌情况的调查.1993年,美国科学家Sti21材料和方法erle从太平洋短叶红豆杉中分离到了一株产新
4、型抗[2]肿瘤活性物质紫杉醇的菌株Taxomycesandrenae,1.1材料引起了人们对研究植物内生真菌抗肿瘤活性的极大植物样品来源:罗汉松、南方红豆杉、三尖杉及兴趣.近年来,国内已陆续报道了从多种药用植物中银杏的树皮和树枝,于2001年3月底采自福建省梁分离获得了产生多种药理活性物质的内生真野山自然保护区.[3～6]菌.表明了植物内生真菌积极地参与植物药物卤虫卵的来源:卤虫卵购自VACUMPACKED中活性物质的合成,是寻找天然活性物质的重要来USA公司,由国家海洋局第三研究所赠送.源.肿瘤细胞株:人白血
5、病HL260细胞和人口腔上罗汉松、南方红豆杉、三尖杉和银杏是一类具有皮癌KB细胞,购自中科院上海细胞所.重要药用价值的裸子植物.例如人们从红豆杉属植1.2方法物中发现分离的紫杉醇,现在已被许多国家用于治[4]内生真菌分离:采用组织块法分离内生真菌,疗卵巢癌和乳腺癌,成为近年来最具抗肿瘤应用价取新采集的茎的树皮和用无菌刀片剥下的侧枝的树值的新药;从三尖杉中开发获得的三尖杉酯碱和高皮,然后用无菌刀片去除外层部分,切成0.5cm×0.三尖杉酯碱是抗白血病的药物,已经被载入到《中华5cm的小块,置于75%的乙醇中消毒5
6、min,无菌水人民共和国药典》;小叶罗汉松的乙醇提取物对HT2冲洗多次,贴放于含终浓度50mgPL庆大霉素的[7]29,A2549,mcF7等瘤株均具一定的抑制作用;银PDA固体平板培养基上,25℃培养,待菌丝长出后,杏的银杏多糖、白果素、双黄酮类等组分也具有抗肿挑取尖端菌丝移到新的固体平板上继续培养,几次纯化后得到内生真菌.内生真菌液体培养和发酵液的处理:取菌丝块收稿日期:2001212207接种于PDA液体培养基中,25℃、160rPmin培养7基金项目:福建省自然科学基金资助项目(C0110002)d,发
7、酵液经冻融、在室温下使用组织匀浆机进行匀作者简介:张永杰(1975-),男,硕士研究生.浆,3000rPmin离心10min,取上清液过滤除菌(滤第6期张永杰等:4种裸子植物内生真菌抗肿瘤菌株的筛选·805·膜孔径0.22μm),-20℃保存备用.茎的内生真菌有69株,占总分离菌株的61.6%;来卤虫孵化:3g的卤虫卵置于大培养皿中,加入源于枝的内生真菌有43株,占总分离菌株38.4%.200mL的人工海水(NaCl29.8g,KCl0.73g,MgCl2·6H2O10.7g,MgSO4·7H2O5.4g,Ca
8、Cl2·2H2O1.1表14种裸子植物内生真菌的分离结果Tab.1Theisolationresultofendophyticfungifrom4speciesofg,加双蒸水定容到1000mL)28℃孵化2h,用吸管gymnoperm把卤虫吸到盛有人工海水的小培养皿中,备用.抗肿瘤活性菌株初筛的卤虫测定:依照Solis的分离菌株数分离部位宿主植物方法[9],稍加修改.在96孔细胞培养
