npm1基因突变as-pcr检测方法的建立及其在白血病中的应用

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1、学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得直昌大堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名c手写编哗签字魄川年学位论文版权使用授权书∽日本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅

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3、血病(acutemyeloidleukemia，AML)是多能干细胞发生突变所形成的一类造血系统的恶性克隆性疾病。随着分子生物学技术不断地应用于临床，越来越多的基因突变检测在白血病诊断、治疗监测和预后评估中得到应用并发挥重要的作用。在急性髓系白血病中，核仁磷酸蛋白(nucleophosmin，NPMl)编码基因是突变率最高的基因之一，其突变状态对白血病患者的生存和预后均有重要影响。因此，对NPMl基因突变的检测显得尤为重要。本课题旨在建立检测NPMl基因突变的等位基因特异性PCR方法，为临床检测急性髓系白血病病

4、人NPMl基因突变提供灵敏、高效而又简便的方法，从而为临床进行急性髓系白血病的治疗效果监测和预后评估提供实验依据。研究策略与方法：1、分别设计并合成5对引物，以健康人淋巴细胞基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到野生型NPMl基因片段和A、B、C、D四种突变型的NPMl基因片段，并分别克隆至载体pEGFP．C1中，作为后续检测的标准品。2、AS—PCR方法的建立。根据等位基因特异性PCR方法(AS．PCR)的原理，设计一对特异引物，以四种突变型的pEGFP—C1．NPMl重组质粒为模板，优化反应体系和反应条件。

5、摸索出该方法检测的最低检测下限，并验证该方法的可行性。3、利用AS．PCR方法检测急性白血病患者NPMl基因突变情况，并分析基因突变与FAB分型、遗传学异常以及预后的相关性。实验结果：1、构建了野生型pEGFP—C1一NPMl(wild)和A、B、C、D四种突变型的pEGFP．CI．NPMl五种重组质粒，经PCR扩增和测序鉴定与预期结果一致，证明质粒构建成功。2、建立了可以同时检测NPMl基因A、B、C、D四种突变体的AS．PCR方法，该方法的检测上限为109copies／ml，检测下限为103copies／m

6、l，野生型NPMl基因在103copies／ml一109copies／ml间对该方法无干扰。3、对临床231例初诊白血病患者标本进行检测，其中62例患者标本有NPMIlI摘要基因突变，阳性率为26．8％(62／231)。其中，M1占33．3％(3／9)；M2占38．9％(28／72)；M3占14％(7／50)；M4占15％(3／20)；M5占41．7％(10／24)；M6占25．0％(1／4)；ALL占25．0％(6／24)；CLL占33-3％(2／6)：CML占11．1％(1／9)和特发性血小板减少性紫癜占1

7、00％(1／1)。结论：1、成功构建了野生型pEGFP—C1一-NPMl(wild)和A、B、C、D四种突变型的pEGFP．C1．-NPMl五种重组质粒。2、建立一种可以同时检测A、B、C、D四种高频突变的AS．PCR方法，能够给临床检测NPMl基因突变提供一种新型的检测方法。3、在AML患者中NPMl突变有明显差异，其中M5和M2患者较为多见。关键词：NPMl；基因突变；AS—PCR方法本文受江西省科技计划项目(No．20121BBG70049)资助111AbstractABSTRACT0bjective：T

8、oestablishallallele．．specificPCR(AS．．PCR)methodtodetectthemutationofNPM1gene，provideasensitive，reliableandsimplemethodforclinicaldetectionofNPM1genemutationsinacutemyeloidleukemiapatients．Method