TRAIL对心肌微血管内皮细胞缺氧-复氧损伤的保护作用及机制研究

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1、单位代码10475学号104753140921分类号Q93河南大学硕士学位论文TRAIL对心肌微血管内皮细胞缺氧-复氧损伤的保护作用及机制研究学科、专业：生物学、微生物学研究方向：生物治疗药物研发申请学位类别：理学硕士申请人：陈小燕指导教师：王耀辉副教授二〇一七年六月THEPROTECTIVEEFFECTOFTRAILONHYPOXIA-REOXYGENATIONINJURYOFMYOCARDIALMICROVASCULARENDOTHELIALCELLANDITSPOSSIBLEMECHANISMThesisSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanUn

2、iversityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceByXiaoyanChenSupervisor:AssociateProf.YaohuiWangJune,2017摘要背景急性心肌梗死（acutemyocardialinfarction,AMI）是一种全球范围内的急性缺血性心脏病，其发病因素主要是在动脉粥样硬化的基础上，堵塞冠脉血液循环，引起局部心肌缺血，造成心肌细胞的大量死亡。临床上对AMI的治疗主要是采用溶栓药物或者直接进行冠脉腔内手术。但是，治疗AMI之后，通常会不可避免的发生心肌

3、缺血再灌注损伤（myocardialischemia/reperfusioninjury，MI/RI），进而引起心肌细胞大量死亡。有研究表明，在I/R中，心肌微血管内皮细胞（myocardialmicrovascularendothelialcell,CMEC）最先受到影响，发生功能紊乱。内皮细胞具有很强的分泌功能，可以通过分泌多种生物活性物质调节体内的稳态平衡，在维持正常心功能以及损伤后的修复方面具有重要的作用。肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（Tumornecrosisfactor-relatedapoptosis-inducingligand，TRAIL）是TNF家族II型跨膜蛋

4、白的一种，参与调节细胞凋亡、炎症反应及免疫应答。近年来，人们对于TRAIL的关注不再仅仅是其高效的凋亡作用，更多的是其在细胞内发挥的复杂生理功能上。大量研究表明，TRAIL在血管病理生理调节中有显著影响，存在潜在的心血管保护作用。研究证实，TRAIL对心血管的保护作用机制可能是通过激活磷脂酰肌醇-2激酶/蛋白激酶B/内皮型一氧化氮合酶（PI3K/Akt/eNOS）通路来实现的。eNOS能够调节内皮细胞NO的释放，而NO具有很强的舒血管功能，能够抑制血管平滑肌的增殖，起到血管内皮细胞保护作用。在AMI早期，血清中TRAIL浓度明显降低，其含量与心梗的严重程度呈负相关。体内外的研究结果证

5、明，TRAIL对心血管疾病具有潜在的血管保护作用，在心肌梗死过程中，微血管内皮功能障碍是导致心肌缺血再灌注损伤的主要因素之一。其中AMI患者血清TRAIL浓度的降低是否是对血管内皮细胞的一种保护作用目前尚不清楚。因此，本课题主要是通过研究TRAIL在缺氧-复氧条件下对心肌微血管内皮细胞功能的影响，为心血管疾病的治疗提供新的作用靶点。I目的本课题主要是从以下几个方面进行：（1）建立成年大鼠CMEC的分离及培养方法，并对CMEC进行内皮细胞特异性表面抗原鉴定；（2）研究TRAIL在常氧和缺氧-复氧条件下对CMEC的作用；（3）探讨TRAIL对CMEC作用的可能机制。方法（1）采用酶消化法

6、分离培养Wistar雄性成年大鼠心肌微血管内皮细胞，鉴定CMEC表面标志物第VIII因子相关抗原和CD31；检测细胞增殖曲线和血管形成能力及DR5蛋白的表达。（2）常氧培养条件下，TRAIL浓度设定为0、25、50、100ng/ml，利用LDH和MTS检测TRAIL对CMEC增殖活力的影响，运用Transwell和划痕实验检测TRAIL对CMEC迁移能力的改变。（3）利用低氧工作站建立CMEC的缺氧-复氧模型。LDH和MTS检测H/R对CMEC的作用，以及缺氧-复氧后添加不同浓度TRAIL对CMEC增殖活力的影响；（4）检测TRAIL对H/R作用后CMEC迁移能力和血管形成能力的影响

7、。实验分组为正常组（Normal）、单纯缺氧-复氧组（H/R）、TRAIL处理组（25，50，100ng/ml），利用Transwell小室和划痕实验检测CMEC迁移能力的改变，RT-PCR检测CMEC的黏附分子ICAM-1和VCAM-1的mRNA表达情况；利用Matrigel基质胶检测CEMC血管形成能力的变化，RT-PCR检测CMEC细胞内VEGF和Ang-1的mRNA表达情况；（5）RT-PCR检测TRAIL对H/R作用后CMEC炎症因子IL-1β和