miRNA-149-5p在2型糖尿病发病中的机制研究

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1、单位代码10475学号104753140939分类号R36硕士学位论文miRNA-149-5p在2型糖尿病发病中的机制研究学科、专业：病理学与病理生理学研究方向：miRNA与糖尿病申请学位类别：医学硕士申请人：刘怡然指导教师：陈卫东教授二〇一七年六月ThemechanismofmiRNA-149-5pinthepathogenesisoftype2diabetesmellitusThesisSubmittedtoTheGraduateSchoolofHenanUniversityInPartialFulfillmentoftheRequiremen

2、tsFortheDegreeofMedicalofScienceByLiuYiranSupervisor:Prof.ChenWeidongJune，201711摘要一、背景作为内源性非编码小RNA，Micro-RNA（miRNA）在细胞内发挥着广泛的调节作用。糖尿病是我国目前最主要的代谢性疾病，其中2型糖尿病（T2DM）占已确诊糖尿病患者的90%以上，且呈年轻化趋势，亟待持续深入的研究。研究发现，miRNA能够参与调控脂肪细胞分化，胰腺发育，β细胞分化，胰岛素生物合成，胰岛素分泌和信号传导，对2型糖尿病的发生、发展及并发症的出现起着重要的作用。因此

3、鉴定新的与2型糖尿病相关的miRNA分子，并揭示其在2型糖尿病发生中的作用机制具有重要的研究价值。二、目的以T2DM患者和健康人群的外周血液作为研究对象，探究miR-149-5p在两组人群中的表达差异，分析其表达水平与糖尿病临床指标之间的相关性；利用生物信息学方法预测和体外细胞实验，筛选出miR-149-5p可能直接调控的靶基因，构建含有靶基因序列的重组质粒并进行双荧光素酶基因活性检测，验证miR-149-5p对靶基因的直接调控作用。使用荧光定量PCR和蛋白免疫印迹技术，检测miR-149-5p水平变化对靶基因水平的影响。研究miR-149-5p对

4、胰岛素信号通路，糖代谢通路，及脂代谢通路相关分子的影响，探究miR-149-5p在T2DM发生和发展中的作用。三、方法1．探究miRNA-149-5p水平与T2DM发生之间的关系a）采集初诊且未经治疗、无并发症的T2DM患者和相仿年龄的健康献血者的空腹外周血液，使用EDTA抗凝处理，置于-80℃冰箱保存。同时收集两组人群的临床生化检测数据及T2DM患者的病历资料。b）在血样中加入外参基因，使用Trizol法提取血液总RNA，加A尾反应使miRNA修饰上Poly(A)尾，逆转录反应得到miRNA的cDNA。c）利用荧光定量PCR技术鉴定两组人群中mi

5、RNA-149-5p表达水平的差异。利用miRNA-149-5p正向引物和反向通用引物扩增miRNA-149-5p分子，同时扩增外参基因作为对照，分析miRNA-149-5p分子水平在两组人群中的表达差异。Id）利用两组人群的临床血液生化数据，分析miRNA-149-5p表达水平分别与空腹血糖水平、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、个体肥胖指数等糖尿病指标之间的相关性。2.筛选T2DM发展过程中miRNA-149-5p可能直接调控的靶基因。a）使用权威的miRNA靶基因预测软件：DIANATOOLS、miRDB和TargetScan，筛选可能受

6、miRNA-149-5p调控且与T2DM发生相关的潜在靶基因b）在肝癌HepG2细胞分别中转染miRNA模拟物miRNA-149-5pagomir，miRNA拮抗剂miRNA-149-5pantagomirr，同时分别转染NC-agomir、NC-antagomir作为阴性对照。使用荧光定量PCR技术，以U6作为内参基因检测miRNA-149-5p在细胞中的表达水平。同时以actin作为内参基因检测过表达或干扰miRNA-149-5p后靶基因的表达情况。初步将表达水平变化明显的基因作为靶基因。c）分析靶基因mRNA的3’非翻译区域（3’utr区域）

7、，确定其可能与miRNA-149-5p结合的潜在区域。设计加入双酶切位点的引物，采用PCR方法扩增出编码靶基因3'utr区域的部分DNA片段，双酶切后克隆入pmirGLO双荧光素酶报告基因载体；菌落PCR鉴定阳性克隆，测序确定载体是否构建成功。d）将空载体和重组载体分别与miRNA-149-5p-agomir或NC-agomir在HepG2细胞中进行共转染，转染后24小时进行双荧光素酶基因报告实验，检测不同组细胞荧光素酶活性的变化情况，在细胞内确定miRNA-149-5p对靶基因的直接调控作用。3．探究miRNA-149-5p对靶基因及胰岛素信号通

8、路的影响a)利用荧光定量PCR技术分析miRNA-149-5p水平改变对靶基因的影响。针对胰岛素信号通路中关键分子AKT，