冬眠不同时期达乌尔黄鼠骨骼肌线粒体钙浓度的变化及调控机制研究

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1、分类号：学校代码：10697密级：公开学号：硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION冬眠不同时期达乌尔黄鼠骨骼肌线粒体钙浓度的变化及调控机制研究学科名称：动物学作者:李晓雨指导老师：高云芳教授西北大学学位评定委员会二○一八年ChangesofmitochondrialcalciumconcentrationinskeletalmuscleofDauriangroundsquirrel(Spermophilusdauricus)duringhibernationanditsregulationmechanismAthesissubmittedtoNorthwestUniversit

2、yinpartialfulfillmentoftherequirementsforthedegreeofMasterinZoologyByLiXiaoyuSupervisor:GaoYunfangprofessor2018摘要摘要研究背景：线粒体钙超载会增加活性氧（reactiveoxygenspecies,ROS）的产生，并伴随着增加非特异性内膜通透性的风险，使线粒体膜电位去极化，致使细胞凋亡或坏死，引起肌肉萎缩。本课题组前期研究发现，冬眠达乌尔黄鼠（Spermophilusdauricus）的典型慢肌比目鱼肌在冬眠不同时期线粒体钙浓度没有发生显著变化，典型的快肌趾长伸肌在冬眠期间出现显著

3、的钙超载现象，并且出眠时没有恢复至冬眠前水平，其他骨骼肌在冬眠不同时期的线粒体钙浓度变化规律及其调控机制尚未明了。单向转运体复合物是线粒体摄钙通道中最重要的复合物，线粒体钙单运体（mitochondrialcalciumuniporter，MCU）是复合物中的关键通道蛋白，可以顺化学梯度摄取钙离子。线粒体钙摄取蛋白1（mitochondrialcalciumuptake,MICU1）和线粒体钙摄取蛋白2（mitochondrialcalciumuptake,MICU2）是MCU的调控蛋白，调控机制受钙浓度影响。依赖亮氨酸拉链-EF-手型跨膜蛋白1(leucinezipper-EF-handc

4、ontainingtransmembraneprotein1，Letm1)是一种线粒体内膜蛋白，可以介导钙离子的排出，对线粒体钙的动态平衡起关键作用。本研究通过测定达乌尔黄鼠不同骨骼肌在不同时期的线粒体钙浓度变化及摄钙蛋白MCU、摄钙调控蛋白MICU1和MICU2，以及排钙蛋白Letm1的基因和蛋白水平表达探索线粒体钙浓度的变化规律及其调控机制。研究目的：1.通过检测达乌尔黄鼠不同骨骼肌在冬眠不同时期的线粒体钙浓度变化，探索达乌尔黄鼠不同骨骼肌在不同时期的线粒体钙浓度变化规律。2.通过测量达乌尔黄鼠不同骨骼肌在冬眠不同时期摄钙蛋白MCU、摄钙调控蛋白MICU1和MICU2，以及排钙蛋白Let

5、m1的基因和蛋白水平表达，探索线粒体钙浓度变化的调控机制。研究方法：1.以夏季活跃组（summeractivegroup，SA）、冬眠前组（pre-hibernationgroup，PRE）、浅冬眠组（earlytorporgroup，ET）、深冬眠组（latetorporgroup，LT）、阵间觉醒组（interboutarousalgroup，IBA）及出眠组（post-hibernationgroup，POST）六组黄鼠的跖肌（plantarislongus，PL）、外侧腓肠肌（lateralgastrocnemius，LG）及半腱肌（semitendinosus，ST）为实验对象，采

6、用单根肌纤维分离技术和激光共聚焦技术测定I西北大学硕士学位论文黄鼠不同时期不同骨骼肌线粒体钙浓度的变化。2.通过实时荧光定量PCR测定不同骨骼肌线粒体钙通道蛋白MCU、MICU1、MICU2和Letm1的基因水平变化。3.通过WesternBlot测定不同骨骼肌线粒体钙通道蛋白MCU、MICU1和Letm1的蛋白水平变化。研究结果：1.不同时期达乌尔黄鼠骨骼肌的线粒体钙浓度变化与IBA组相比，浅冬眠组的黄鼠腓肠肌线粒体钙浓度下降了4.34%（P<0.05），其余各组无明显差异；黄鼠跖肌的线粒体钙浓度在IBA时期略有升高，但没有统计意义。在冬眠不同时期均没有显著差异；与PRE组和IBA组相比，

7、黄鼠半腱肌的线粒体钙浓度在EL组分别升高了5.99%（P<0.01）和3.29%（P<0.01）。2.不同时期达乌尔黄鼠骨骼肌线粒体钙通道蛋白的基因和蛋白水平表达（1）腓肠肌mRNA相对表达量：与SA组相比，MCUmRNA在LT（70.06%，P<0.01），POST（91.53%，P<0.001）组均升高；IBA和ET时期MICU1（IBA（31.2%，P<0.05），ET（49.35%，P<0.01）），