游离甲状腺素与游离三碘甲状腺原氨酸的时间分辨荧光免疫检测试剂的研究

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1、南方医科大学2010级博士学位论文游离甲状腺素与游离三碘甲状腺原氨酸的时间分辨荧光免疫检测试剂的研究DevelopmentofDetectionReagentsforFreeThyroxineandFreeTriiodothyronineUsingTime·resolvedFluoroimmunoassay课题来源：学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次王征李明教授免疫学非定向博士所在学院生物技术学院答辩委员会主席答辩委员会委员朱家勇余新炳悄良瑜曾令文裘宇容杨晓明吴英松2013年5月29日教授广州1㈣磐㈣博士学位论文一游离甲状腺素与游离三碘甲状腺原氨酸的时

2、间分辨荧光免疫检测试剂的研究博士研究生：王征指导教师：李明教授摘要研究背景及目的人体血清中的甲状腺素(Thyroxine，T4)和三碘甲状腺原氨酸(Triiodothyronine，T3)绝大部分是与甲状腺结合球蛋白(thyroxine～bindingglobulin，TBG)、甲状腺结合前白蛋白(Thyroxine—bindingprealbumin，TBPA)和白蛋白结合，仅有约0．03％的T4和0．3％的T3以游离的状态存在。然而，正是这些极微量的游离分子(FT4，FT3)发挥着人体代谢的生理作用，成为评价人体甲状腺功能的重要指标。平衡透析法是准确测定人

3、血清中FT4和FT3的金标准方法，但由于其技术要求较高而且操作相当费时(通常需要16—24小时)，因而限制了其在临床实验室的广泛使用。标记免疫学的迅猛发展使得FT4和FT3的快速准确测定成为可能，现今已经出现了如放射免疫分析(Radioimmunoassay，RIA)、化学发光免疫分析(ChemilinescentImmunoassay，CLIA)、时间分辨荧光免疫分析(Time-resolvedFluoroimmunoassay，TRFIA)及电化学发光(ElectricalChemilinescentImmunoassay，ECLIA)等这些方法学的FT4

4、／FT3检测试剂。将这些方法学进一步分类，可将FT4的检测试剂分为三类：两步法、一步类似物法和标记抗体法。两步法尽管测值准确性较高，但操作复杂，耗时长；一步类似物法操作简便，精密度好，但准确性一直备受质疑；标记抗体法是目前许多商业化试剂公司普遍采用的方法，它综合了两步法和一步类似物法各自的优点，博士学位论文因此被越来越广泛的运用。实际上，无论采用哪种方法，其中的关键难点在于测定的过程中尽量最少程度的破坏T4或T3与结合蛋白之间的平衡。时间分辨荧光免疫分析(Time—resolvedfluoroimmunoassay，TRFIA)是一种高灵敏的定量免疫检测技术，

5、其独特的地方在于用镧系稀土离子作为标记物来标记抗原或抗体，因镧系稀土离子具有独特的荧光特性，该技术能够获得极高的信噪比，从而具有很高的灵敏度，且还具有标记物制备简便、储存时间长、无放射性污染、检测重复性好、操作流程短、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰和应用范围广泛等优点。本论文采用时间分辨荧光免疫分析法对人血清中的FT4与FT3检测进行了深入广泛的研究。我们采用标记抗体法建立了一套快速、灵敏、可靠的FT4／FT3时间分辨荧光免疫分析方法。本论文分为四个部分，分别为综述、五种甲状腺激素衍生物的合成以及偶联物的制备、血清FT4的TRFIA研究、血清FT3的TR

6、FIA研究。论文的综述部分详细介绍了时间分辨荧光免疫分析法的方法学特点和FT4／FT3检测方法的进展情况；论文的第二部分详细描述了五种甲状腺激素衍生物的合成以及偶联物的制备情况，旨在为论文的第三、四部分的方法学研究提供重要的原料基础；论文的第三部分与第四部分以Eu3+为标记物分别对血清FT4并IFT3的TRFIA进行了研究，我们首先通过比较不同的偶联物产生的灵敏度高低差异来选取灵敏度最高的确定为最佳的偶联物，然后用此最佳偶联物来建立FT4／FT3的TRFIA，并进行了详细的性能评价和鉴定。方法：(一)采用化学合成的方法合成了五种甲状腺激素衍生物并分别将其与兔I

7、gG偶联制备了其相应的兔IgG偶联物。I．以辛二酸作为起始原料，在DCC和NHS的作用下反应得到辛二酸的双NHS酯结构；博士学位论文2．以T4、T3作为合成起始原料在HCL的甲醇溶液中反应分别得到T4甲酯和T3甲酯；3．以T4、T3、T4甲酯、T3甲酯和T2作为合成起始原料与辛二酸的NHS酯以摩尔比为1：2．1反应形成各自的衍生物的单NHS酯结构；4．将五种衍生物的单NHS酯与兔IgG以摩尔比100：1的比例进行偶联反应，反应于室温下搅拌20h后用分子筛进行纯化，并用BCA法分别测定这五种偶联物浓度。(二)血清FT4时间分辨荧光免疫分析法的建立1．利用活性炭、

8、高岭土制备去激素人血清作为校准品配制用