脂联素基因表达载体构建及体外表达的研究

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1、脂联素基因表达载体的构建及体外表达研究硕士研究生：张丹指导教师：苏本利教授专业名称：内科学摘要随着脂肪细胞因子的不断发现，目前认为，脂肪组织已不再是仅供能量储备的器官，它是～个具有多种内分泌功能的内分泌器官。脂联素(Adiponectin，APN)是由分化的脂肪细胞特异性分泌的一种蛋白质，在体内和体外实验中被证实具有增加脂肪酸氧化、改善胰岛素抵抗、抗动脉粥样硬化等作用。在临床上，低APN血症与肥胖、2型糖尿病及心血管疾病密切相关。Kubota等人研究发现，杂合子小鼠(adipo+／o)与野生型小鼠相比表现出微弱

2、的胰岛素抵抗，而纯合子小鼠(adipo．／．)表现出中度的胰岛素抵抗和轻微的糖耐量异常；且APN敲除纯合子小鼠(adipo．／-)在给予外源性(机械性)血管损伤后，其动脉内膜增厚的发生率要比野生型小鼠高两倍以上，而感染能产生APN的腺病毒之后却能完全扭转动脉内膜的过度增生。因此，APN在体内可能有改善胰岛素抵抗和抗动脉粥样硬化的作用。APN基因治疗可能为肥胖、2型糖尿病和动脉粥样硬化等疾病开辟新的治疗途径。2型糖尿病常常与胰岛素抵抗、高血压、血脂紊乱及慢性低度炎症反应(通称代谢综合征，MS)同时存在，上述因素是

3、动脉粥样硬化危险因素，他们之间可能存在共同的发病机制。本研究旨在构建APN基因表达载体，研究其在体外培养的表达情况，为进一步研究APN基因转移抗糖尿病、抗动脉粥样硬化作用打下基础。目的：构建人APN(humanAPN；hAPN)基因的质粒表达载体，并检测其体外转染后能否在真核细胞中表达，探讨该APN基因表达载体的构建是否成功。方法：1．构建pMDl8-hAPN从人的脂肪组织中提取总RNA，根据其编码区基因设计引物，行反转录一多聚酶链反应(R1二PcR)，将RT-PCR产物用XhoI和HindIII酶切后，克隆到

4、pMDl8．TsimpleVector中(命名为pMDl8．hAPN)，筛选阳性克隆并对插入片段(hAPN)测序。2．构建pLNCX2．hAPN用XhoI和HindIII酶切pMDl8-hAPN，得到插入片段hAPN，将该片段定向克隆到质粒pLNCX2中(命名为pLNCX2．hAPN)，筛选阳性克隆并对插入片段(hAPN)测序。3．质粒pLNCX2-hAPN和pLNCX2转染入胚肺(HFL)细胞系用脂质体转移法将pLNCX2．hAPN和pLNCX2转染HFL细胞系细胞，经氨基糖苷(G418，一种新霉素类似物)筛

5、选后继续培养，提取培养细胞的总RNA，用RT-PCR检测HFL细胞内hAPN基因在mRNA水平的表达。结果：1．直接测序结果显示质粒pLNCX2．hAPN的hAPN基因片段插入方向及核酸顺序与预计的相符合。2．RT-PCR结果显示此质粒pLNCX2．hAPN能在HFL细胞中表达。结论：成功地构建了一种hAPN基因表达载体pLNCX2一hAPN，该质粒可以在体外真核细胞中表达关键词：脂联素基因克隆细胞转染·2·Constructionofahumanadiponectinexpressionvectorandit

6、sexpressioninvitroPostgraduate：ZhangDanSupervisor：prof．SuBenliMajor：EndocrinologyandmetabolismAbstractBackground：Withthediscoveryofadiposefactors，itissuggestedthatadiposetissueservesnotonlyasanenergyreservoirbutalsoallendocrineorgan．Adiponectinisexclusivelye

7、xpressedindifferentiatedadipocytes．Itisprovedtohavethefunctionofenhancingfattyacidoxidation，reverseinsulinresistanceandresistatherosclerosisinvitroandinvivo．Decreasedexpressionandlowerlevelofadiponeetincorrelateswithobesity,type2diabetesandcardiovasculardise

8、ases．Heterozygousadiponectin-deficient(adipo+／-)miceshowedmildinsulinresistance，whilehomozygousadiponectin-deficient(adipo-／-)miceshowedmoderateinsulinresistancewithglucoseintolerance．Moreover,a