乙醇型发酵产氢菌代谢通量分析及产氢调控机制研究

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1、乙醇型发酵产氢菌代谢通量分析及产氢调控机制研究MetabolicFluxAnalysisofEthanoltypeFermentationHydrogenProductionBacteriaandResearchonRegulationMechanism研究生：贾苏荣指导教师：胡俊生教授唐婧副教授学科领域：环境工程二〇一五年十二月分类号：学校代码：10153UDC：密级：公开硕士学位论文乙醇型发酵产氢菌代谢通量分析及产氢调控机制研究作者姓名：贾苏荣入学年份：2013年9月指导教师：胡俊生教授学科领域：环境工程申请学位：工程硕士所在单位：市政与环境工程学院论

2、文提交日期：2015年11月论文答辩日期：2015年12月学位授予日期：2016年1月答辩委员会主席：潘俊答辩委员会组成：魏炜徐厚生潘俊李军陈欣论文评阅人：声明本人声明，所呈交的学位论文是在导师的指导下独立完成的。论文中取得的研究成果除加以标注和致谢的地方外，不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包括本人为获得其他学位而使用过的材料。与我共同工作过的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。作者签名：日期：2015年12月学位论文版权使用授权书本学位论文作者和指导教师完全了解沈阳建筑大学有关保留、使用学位论文的规定：即学校有权保

3、留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权沈阳建筑大学（或其授权机构）可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并通过网络提供检索、浏览。（如作者和导师同意论文交流，请在下方签名；否则视为不同意。）作者和导师同意网上交流的时间为作者获得学位后：不限□半年□一年□一年半□两年□作者签名：导师签名：日期：2016年1月日期：2016年1月硕士研究生学位论文摘要I摘要发酵法生物制氢以降解污水和回收能源的双重功效而受到广泛的关注，目前提高发酵产氢效率是实现工程应用的瓶颈问题，而解除微生物产氢代谢中存在的产物抑制是有效途径之一。

4、本研究以乙醇型发酵的典型菌种E.harbinenseB49为研究对象，利用代谢通量分析探讨微生物产氢机理，探究液相末端产物抑制对产氢代谢通量的影响，利用双极膜电渗析与发酵产氢耦合分离主要抑制产物乙酸，对不同运行模式进行代谢通量分析，明确产氢代谢关键点位，为提高厌氧菌的产氢代谢通量，增强乙醇型发酵的产氢效率提供理论支持。依据推测的产氢途径简化得到了包括EMP、PPP和TCA三大代谢途径的E.HarbineseB49代谢网络，建立了适用于E.HarbineseB49代谢网络的化学计量模型，整个代谢网络中包含14个方程（生化反应）和14个未知数（代谢产物），其中

5、底物葡萄糖和末端代谢产物乙酸、乙醇、丁酸、二氧化碳和氢气需要通过实验测得，再根据中间代谢产物的物料平衡来计算胞内的代谢通量，将实验数据归一转化成分析数据后可绘制出相应的代谢通量分布图。利用已建立的E.HarbineseB49代谢通量分析方法对外加不同浓度乙酸和乙醇的产氢代谢进行分析，该网络存在两大产氢前体Fdred和NADH，外加乙酸使乳酸通量增加，消耗产氢前体NADH，导致氢气产量下降；外加低浓度乙醇对整体代谢影响不大，对产氢的影响主要是丙酮酸（PYR）至乙酰辅酶A(AcCoA)途径通量的减少，导致该途径中生成的产氢前体Fdred的减少，而高浓度乙醇会使

6、整体代谢速率下降。通过各节点在不同浓度对初始浓度的差值与初始浓度的百分比的变化大小确定关键节点，根据这些节点生成和消耗速率的线性关系判定节点的鲁棒性，其中G6P属于挠性节点，可以通过改变G6P节点处的酶活性（己糖激酶）来提高H2的产量；PYR属于刚性节点，节点处的代谢给细胞提供了很大的刚性以控制细胞在不同环境下的能量和胞内通量的变化；乙酰辅酶A为弱刚性节点，对于PYR和乙酰辅酶A这种刚性和弱刚性节点来说，可以利用包括基因工程手段以及传统育种方法解除中间代谢产物对这些酶的反馈抑制来提高H2的产量。在工程手段方面可以采用分离抑制产物的方法提高产氢效率。利用已建

7、立的E.HarbineseB49代谢通量分析方法对传统发酵制氢、发酵与分离耦合制氢的间歇运行模式、补料运行模式的产氢代谢进行分析，三种模式的产氢通量分别是208.3、-1210.4和238.5mmol/gCDWh，补料模式的产氢代谢通量最大，其产氢调控机制在于通过分离乙酸而加大了产乙酸代谢途径，进而加大了PYR到AcCoA的通量，使得两大产氢前体Fdred和NADH的增加，从而在产氢效率方面大于传统发酵模式和间歇运行模式。乙酸的连续分离和底物的补充有助于提高产氢能力，对传统发酵、电渗析连续分离乙酸、连续分离连续补料耦合的实验进行了对比研究，研究发现连续分离

8、耦合实验能连续高效的分离乙酸，获得比产氢率为1.65molH2/m