胶体金免疫层析法快速检测迟钝爱德华氏菌

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1、’游誦学韋０３００９０３４９±学＜ｉｉ论文＊ＶＩ胶体金免疫层析法快速检测迟鈍ｉｔｉＳＳ目：—Ｉ—－－■？■爱德华穿氏茵—海洋生物学学科专业：病原检洩！Ｉ研究万向：论文作者：刘和松指导教师：张元兴教授．？■定稿２〇１２〇４Ｉ９日期：年月日学位论文使用授权声明本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子版，。ｉ允许论文被查阅和借阅本人授权华东理工大学可ｙ？将本学位论文的、全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可Ｗ采用影印

2、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。保密论文在解密后遵守此规定。论文涉密情况：＾不保密□保密，保密期（年月日至年月日）＿＿＿＿＾＿＿＿＿学位论文作者签名：么、指导老师签名；曰期）；兴古年ｒ月曰曰期年ｆ巧曰ｉ诚７９３分类号：Ｑ密级＝公开ＵＤＣ：华东理工大学学位论文胶体金免疫层析法快速检测迟纯爱德华氏菌刘和松指导教师姓名：张元兴（教授）肖猜凡（博１华东理工大学，上海市梅陳路３０号２０胆３７：硕±专业名称申请学位级别：海洋生物学论文定稿日期：２０１２．４．１９论文答辩日期：学位授予单位；华东理

3、工大学，学位授予日期：答辩委员会主席；评阅人：作者声明我郑重声明；本人恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的结果。除了文中明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何他人己经发表或撰写过的内容。论文为本人亲自撰写，并对所写内容负责。论文作者签名；如和卞ｔ＼２０１２年４月１９日华东理工大学硕±学位论文第Ｉ页胶体金免疫层析法快速检测巧纯爱德华巧菌摘要’迟鈍爱德华氏菌妨ＨＷ妃化Ｗａ一（ｚｅ航！）是种重要的鱼类病原菌，由它引起的迟纯爱德华氏菌病对海水鱼和淡水鱼都具有很

4、高的致死率。为了及时采取有效措施控制迟纯爱德华氏茵病的暴发，迫切需要建立便捷、准确的方法对広ｔｏＷａ早期感染进行快速准确的诊断。本课题制备了Ｅｔｏｎ虹单克隆抗体和多克隆抗体，并用其制备了ｔｏｒ舶检测试纸条，同时将此方法与斑点杂交和环介导等温扩增方法进行了比较。用巧樣酸还原氯金酸的方法制备了各种不同粒径的胶体金溶液，并用可见光谱和透射电镜评价了胶体金溶液的分散性、形状Ｗ及粒径分布。选择粒径为３０ｎｍ的胶体金颗粒标记Ｅｔｏｎ沁多克隆抗体，并将其吸附至玻璃纤维素膜上，将ＥｆａＷａ多克隆抗体和羊抗兔二抗包被于分析膜上预定的检测线（巧和质控线（Ｃ）上，然后将

5、金标垫、样品垫、＾。ａＷｆｌ分析膜＾＾＾及吸水垫组装成检测试纸条该试纸条对ｆ特异性良好，检测兰株与其他环境常见细菌无交叉反应７化施均为阳性结果。该试纸条检测限为１０ＣＦＵ／ｍｌ，５？ｍｎ（３１０ｉ内），延长反应时间后可达到１０ＣＦＵ／ｍｌ。自渔场采集疑似罹患迟纯爱德华氏菌病的大菱解腹水，Ｗ试纸条检测结果为阳性，同时采用传统生理生化和１６ＳｒＤＮＡ测ｓ？５ｘ序签定该大菱辑确为Ｅｔｏ，麻感染，且腹水中该菌浓度为ｌ〇ＣＦＵ／ｍｌ。为提高检测试纸条的灵敏度，制备了丘ｔｏｎ沁单克隆抗体。提取ＥｔｏＷａ外膜蛋白，并用其免疫Ｂａ／ｃ小鼠。经Ｈ次免疫后，选择血清中

6、抗体ＥＬＩＳＡ效价较离的两只小鼠，ｌｂ。制备分散的脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞进行两次融合经过筛选和克隆，获得了两株能够稳定分泌具有良好特异性和亲和力单克隆抗体的杂交瘤细胞株。将这两株杂交瘤经培养后．ｔｏＷａ单克隆。，注入小鼠腹腔产生腹水。抽取的腹水经蛋白Ｇ亲和纯化得到￡抗体经亚型鉴定分析，二者均为ＩＧ。ｇ２ｕ经抗体匹配实验后，用胶体金颗粒标记单克隆抗体，并将其吸附至玻璃纤维素膜上，将单克隆抗体和羊抗鼠二抗包被至分析膜上预定的检测线ＣＯ与质控线（Ｃ），然后将金标垫、样品垫、分析膜和吸水垫组装成检测试纸条。经过优化后，该检测试纸５条的灵敏度达到ｘ￣５ｌ〇

7、ＣＦＵ／ｍｌ３１０ｍｉｎ，内即可观察结果，特异性良好，与其他海水及？沁鱼类常见细菌无交叉反应，检测２０株左．ｔｏ，，阳性检出率为１００％。为评价所制备的检测试纸条的性能，将试纸条检测方法与斑点杂交和环介导等温扩５５增方法进行了比较。试纸条的检测限５Ｘ１０ＣＦＵ／ｍｌ虽高于斑点杂交（ＩｘｌＯＣＦＵ／ｍｌ口环（）巧３介导等温扩増〇ｘｉ〇ＣＦＵ／ｍｌ），但是试纸条检测方法方便快捷，可于样品采集现场进行？检测操作理其他试剂和昂贵的仪器设备，在３１０