雷帕霉素对大鼠脊髓损伤的保护作用及机制研究

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1、雷帕霉素对大鼠脊髓损伤的保护作用及机制研究ProtectivenessofRapamycinonSpinalCordInjuriesofRatsandItsRelativeMechanisms作者姓名：宋宇专业名称：人体解剖与组织胚胎学研究方向：干细胞与组织工程指导教师：陈东教授学位类别：医学博士培养单位：基础医学院论文答辩日期：20156年月3日授予学位日期：年月日论文评阅人：答辩委员会组成：姓名职称工作单位姓名职称工作单位李和教授华中科技大学主席贾继辉教授山东大学周德山教授首都医科大学委员李晓萌教授东北师范大学刘慧雯教授哈尔滨医科大学李凡教授吉林大学盲审专家教授赵华教授吉林大学盲审专家研究

2、员陈立教授吉林大学中文摘要脊髓损伤（spinalcordinjury,SCI）的病理过程包括原发性和继发性损伤，前者指暴力发生时脊髓的不可逆性损伤，后者是在此基础上发生的局部缺血、水肿、电解质紊乱等一系列生理生化反应。缺血缺氧和炎症反应均能引起活性氧(reactiveoxgenspecieces，ROS)的产生和释放，ROS大量堆积导致局部组织氧化损伤，神经细胞发生凋亡和坏死。寻找有效药物减少脊髓神经元继发性死亡，一直以来都是人们研究的热点。雷帕霉素（Rapamycin,Rap）是肾移植术后抗排斥反应药物，是一种高效的免疫抑制剂。近期发现，雷帕霉素又具有上调自噬的作用。中枢神经系统创伤性疾病研

3、究显示，雷帕霉素会随动物种类和疾病模型不同而发挥截然相反的作用，脊髓损伤时，雷帕霉素是否具有神经保护作用，目前尚无定论。本研究建立大鼠脊髓损伤模型，观察雷帕霉素对损伤脊髓是否具有保护作用；选择H2O2氧化损伤PC12细胞模型，进一步探讨雷帕霉素对神经细胞的保护作用机制，通过NF-kB和NLRP3炎症小体表达情况，初步探索自噬和炎症之间相互作用的关系，论文分以下两部分阐述。第一部分雷帕霉素对脊髓撞击损伤大鼠的神经保护作用目的：建立大鼠脊髓损伤模型，观察雷帕霉素是否具有上调自噬、下调炎症以及抑制凋亡的神经保护作用。方法：Wistar雌性大鼠45只。开椎板假手术组3只，42只大鼠制备脊髓撞击损伤模型

4、，随机分成雷帕霉素治疗组和损伤对照组。术后3d、7d、14d取材，进行H-E染色、ED-1染色、GFAP免疫荧光染色，观察脊髓损伤病理学变化；酶组织化学法检测组织髓过氧化物酶(MPO)浓度；Westernblot法检测炎性因子TNF-α、IL-1β、自噬相关蛋白Beclin-1的表达；TUNEL法检测脊髓组织细胞凋亡指数；NF免疫组化染色观察脊髓组织中存活神经元。结果：成功建立大鼠脊髓撞击损伤模型，术后3d雷帕霉素治疗组MPO值I低于损伤组(P<0.05)，Westernblot结果显示雷帕霉素组炎性因子IL-lβ，TNF-α表达低于损伤组(P<0.05)，自噬相关蛋白Beclin-1表达高于

5、损伤组。术后7dED-1阳性小胶质细胞在雷帕霉素组明显少于损伤对照组(P<0.05)，术后14dGFAP荧光染色阳性星型胶质细胞，雷帕霉素组有减少趋势，但与损伤组之间无显著性差异。H-E染色结果显示，在损伤区与正常脊髓交界处，损伤组炎症细胞数目较多。TUNEL结果显示，雷帕霉素组凋亡细胞数目明显减少(P<0.05)。NF染色显示，雷帕霉素组神经元数目明显多于单纯损伤组(P<0.05)。结论：雷帕霉素作用于大鼠脊髓撞击损伤，不仅可以上调自噬；而且能够抑制小胶质细胞活化和增殖、减少中性粒细胞及淋巴细胞浸润，减少炎性因子表达，减轻了神经组织继发性炎症反应；雷帕霉素最终减少凋亡细胞数量，增加神经元存活

6、，对损伤脊髓具有保护作用。关键词：脊髓损伤；雷帕霉素；自噬；炎症；凋亡；大鼠第二部分雷帕霉素对氧化应激损伤PC12细胞的保护作用及机制研究目的：观察雷帕霉素预处理对氧化应激损伤PC12细胞的保护作用，从自噬和炎症之间的关联信号通路探讨雷帕霉素保护作用的机制。方法：实验共分五组：正常PC12细胞组；H2O2+PC12组；RAP+H2O2+PC12组；RAP+SN50+H2O2+PC12组；3-MA+H2O2+PC12组，制备H2O2氧化损伤PC12细胞模型。MTT法检测各组细胞存活率；光学显微镜观察细胞形态学变化；MDC染色观察细胞自噬囊泡变化；ROS染色观察细胞活性氧变化；ELISA法检测培养

7、上清和细胞内炎性因子TNF-α、IL-1β变化；Westernblot法检测自噬相关蛋白Beclin-1、LC3，促凋亡蛋白Bax、Cleave-caspase3，炎症信号通路NF-kB、炎症小体NLRP3、炎性因子IL-1β表达变化。结果：200μMH2O2处理PC12细胞24h，成功构建氧化损伤细胞模型。MTT法结果提示Rap和Rap+SN50组与H2O2组比较，细胞存活率增加；3-MA组与H