k88ac~+产肠毒素大肠杆菌sepa基因缺失株的构建及其相关功能探析

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2、＋Ｋ８８ａｃ产肠毒素大肠杆菌ｓｅｐ／Ｉ基因缺失株的构達及其相关功能探析－疗．；声了气、－－－－？’？＂＇？二：？心《ｃｇｉ－＾＊＾禾一＇一戶、—、＊苗式：Ｖ二吗奔户，潘耗終扛１．－？Ｔ＾；；，、＇、，：朱国强教授指导教师姓名．扬州大学．江苏扬州．２巧００９苗，产症．：硕去学科专业名称申请学位级别：预防兽医学论文提交日期：２０１５年４月论文答辩日期：２０１５年６月－＇学位授予单位■＝扬州大学学位授予日期：２０１５年６月ｆ．＾？答辩委员会主席：郭爱珍教授嗦批三．．，亡．着＇哪著－加绿勺、：，；

3、胸护芯二古的赛Ｙ拆芙呵＇謗、斯－苗，Ｖ嫁产；赵两、’兴．您全令《产麵Ｖ：名屬年６月＇线．如．＊责；：載＆穀．推．’．－＾－－在冷＇、？．乏二：＇户鸣５知＇考一；、驗ｆ：；．Ｖ或涛妾乂巧巧＋Ｋ８８ａｃ产肠毒素大肠杆菌ｓ６ａ４基因缺失株的构建及其相关功能探析Ｔｈｅｃｏｎｓｔｒｕｅ村ｏｎｏｆｔｈｅ的ｅｎｅｄｅｌｅｔｉｏｎｍｕｔａｎｔｓｏｆｇ＋Ｋ８８ａｃＥｎｔｅｒｏ化ｘｉｅｎｉｃ扔巧ａｎｄｒｅｌａｔｅｄ化ｎｃ村ｏｎｇａｎａｌｓｉｓｙ硏究生：宋玉洁导：朱国强教授リ巾扬州大学畜禽病原微生物硏究室２０１

4、５年６月＞Ｋ８８ａｃ产肠毒素大肠杆菌ｓ基因缺失株的构建及毒为功能探析１ｇ如＿＋Ｋ８８ａｃ产肠毒素大肠杆菌基因缺失株的构建及其毒力功能探析中文摘要，尤其是断奶仔猪腹泻的主要病原菌产肠毒素大麻杆茜（ＥＴＥＣ）是引发幼畜，被ＥＴＥＣ感染后的仔猪常因剧烈水样腹泻迅速脱水死具有很高的发病率和死ｔ率，给养猪业带一来了严重的经济损失。而菌毛（黏附素）Ｋ８８是ＥＴＥＣ引发腹泻最重要的毒力因子之。＋Ｋ８８ＥＴＥＣ侵入宿主肠道后，通过黏附素Ｋ８８与宿主细胞表面受体特异性结合，从而介导细菌定居、繁殖、肠毒素分泌及适当途径的肠毒素传递，导致腹泻。ｅｎｅａｎ一ｃ

5、ｏ一实验根据ＧＢｋ上已公布的株怎／ｉ上的基因序列，设计对引物Ｗ扩增＋Ｗ－检测Ｋ８８ａｃ产肠毒素大肠杆菌国内标准株Ｃ８３９０２（ｉＷｔｙｐｅ〇８：Ｈ８７巧１９的基因，，）中’’根据实验菌株的ｓｅ如序列设计缺失引物，该缺失引物５端与Ｓ巧＾两翼序列同源，３端与质粒ｐＫＤ３上ｃａｆ基因两翼序列同源。Ｗ质粒ｐＫＤ３为模板，应用缺失引物扩增出中间为抗性基因片段、两端与基因上下游同源的ＤＮＡ片段。将其融合片段导入含有质粒ｐＫＤ４６的Ｃ８３９０２菌株内，在Ｓ种重沮酶的作用下，实现氯霉素抗性基因片段与ｓｅ如发生同源重组性平板上挑取单菌落并进行ＰＣＲ鉴定一，在氯霉素抗，筛选

6、出次同源重组菌Ｃ８３９０２Ａｍ＾一：：ｃＣＰ２０导入重姐酶；４如。将质粒ｐ次同源重组菌内，通过利用其编码的Ｆｌｐ，，经ＰＣＲ鉴定与测序验证进行氯霉素抗性基因的消除，成功构建出Ｃ８３９０２缺失株：Ｃ８３９０２ｓｅ〇ＡｐＡＩＰＥＣ－Ｊ２细胞的体外ｓｅ黏附实验结果表明，如基因缺失株比野生株的黏附能力下降５５－．３％；通过ＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲ实验检测分析５６基因缺失株主要毒力因子转录量的变化，＿的’结果发现鞭毛（邦Ｃ）、菌毛（／ａｅＧ）、热不稳定肠毒素（６／巧）、溶血素ａ沁４）、Ｉ型茵毛基因的表达量与野生株无明湿差异；通过兔回肠结扎实验，观察到缺失株较

7、野生株肠段积液量更多，且缺失株导致回肠的病理变化更为严重。一，综合上述实验结果，ＳｅｐＡ在介导Ｃ８３９０２对宿主细胞黏附的过程中起到了定作用而ＳｅｐＡ可能会抑制Ｃ拆９０２麻毒素的分泌量，达到与宿主长期共存的目的。－：产肠毒素大肠杆菌Ｃ８３９０２ＸＲｅｄ同源重组系统ＳｅＡ关键词；；黏附；巧光定量ＰＣＲ；ｐ；肠毒素扬州大学硕壬学位论文２＾ＴｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｅｐＡｇｅｎｅｄｅｌｅｔｉｏｎｍｕｔａｎｔｓｆｒｏｍ