寨卡病毒复制子反式包装系统的构建和药物筛选应用

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1、：学校代码分类号：１０１４０密级：公开学号：４０３１５３１８５８？，＇（￡￥聲ＬＩＡＯＮＩＮＧＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ硕士学位论文ＴＨＥＳＩＳＦＯＲＭＡＳＴＥＲＤＥＧＲＥＥ寨卡病毒复制子反式包装系统的构建论文题目：和药物筛选应用－ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＺｉｋａＶｉｒｕｓＲｅｌｉｃｏｎＴｒａｎｓＰａｃｋｉｎＳｓｔｅｍｐｇｙ英文题目：ａｎｄＤｒｕｇＳｃｒｅｅｎｉｎＡｌｉｃａｔｉｏｎｓｇｐｐ论文作者：刘娜指导教师：郑方亮

2、副教授专业：微生物学完成时间一八年五月：二〇辽宁大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立完成的。论文中取得的研究成果除加以标注的内容外，不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，不包含本人为获得其他学位而＇使用过的成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中进行了标注，并表示谢意。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：ｉ關＞〇成年ｙ月从曰ｔ学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了

3、解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的原件、复印件和电子版，允许学位论文被查阅和借阅。本人授权辽宁大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。同时授权中国学术期刊（光盘版）电子杂志社将本学位论文收录到《中国博士学位论文全文数据库》和《中国优秀硕士学位论文全文数据库》并通过网络向社会．公众提供信息服务Ｑ学校须按照授权对学位论文进行管理，不得超越授权对学位论文进

4、行任意处理。。（保密（），在年后解密适用本授权书保密：请在括号内＿“”划Ｖ）：授权人签名：指导教师签名－曰期：＞〇化年ｙ月噠曰曰期：ｗｒ年４申请辽宁大学硕士学位论文寨卡病毒复制子反式包装系统的构建和药物筛选应用ConstructionofZikaVirusRepliconTrans-PackingSystemandDrugScreeningApplications作者：刘娜指导教师：郑方亮副教授专业：微生物学答辩日期：2018年5月23日二○一八年五月·中国辽宁摘要摘要Zik

5、avirus（ZIKV）是一种虫媒传播病毒，与登革病毒、黄热病毒和西尼罗病毒等都是一个单股正链的RNA病毒，属于黄病毒属，黄病毒科。自1947年4月从发热的哨兵恒河猴的血清中分离后，已经在很多国家和地区引起疫情并且流行开来，与严重的临床表现和先天性畸形有关。但是，目前还没有有效的抗病毒药物和疫苗可以用于ZIKV的临床治疗，因此对于安全有效的ZIKV抗病毒药物和疫苗的研究刻不容缓。复制子系统已经被证明是一个有效的药物筛选工具。在本文中，我们主要开展了以下三个方面的工作：稳定表达海肾荧光素酶（Rluc）的Z

6、IKV复制子的构建；复制子用于抗病毒药物筛选实验；ZIKV复制子反式包装系统的构建。一、稳定表达海肾荧光素酶（Rluc）的ZIKV复制子的构建在本文中，我们在ZIKV感染性克隆的cDNA基础上构建了一个ZIKV复制子(Rluc-ZIKV-Rep)。在这个复制子中，引入了一个表达海肾荧光素酶的报告基因Renillaluciferase，复制子在细胞中的表达和复制可以通过细胞中的海肾荧光素酶活性和RT-PCR检测到。二、复制子用于抗病毒药物筛选实验在抗病毒药物筛选研究中，我们使用了一些小分子药物，特别是马尼

7、地平和西尼地平。随着这些药物浓度的增加，Rluc-ZIKV-Rep在细胞内的复制呈现剂量依赖的抑制效应。证明我们构建的ZIKV复制子是一个有效的抗病毒药物筛选的工具。三、ZIKV复制子反式包装系统的构建在本文中，运用反向遗传学的方法构建ZIKV复制子的反式包装系统，通过PCR的方法从ZIKV感染性克隆的cDNA上扩增出ZIKV的结构蛋白基因，构建了一个含ZIKV结构蛋白的真核表达载体——CprME-pcDNA3.1，并通过WesternBlot鉴定了其在两种不同细胞（293T和Vero）中的表达。为了制

8、备复制子包装颗粒，我们将复制子和表达结构蛋白的质粒通过共转染和顺次转染的方法转入细胞，使结构蛋白基因和非结构蛋白基因共表达于细胞中。然后，收集细胞上清，继续感染Vero细胞，通过检测细胞中的荧光素酶活性，定量复制I摘要子包装出的缺陷型病毒的产量。在此基础上，我们可以通过293T细胞制备出缺陷型的病毒样颗粒，为ZIKV新型疫苗的研究奠定基础。关键词：寨卡病毒，复制子，抗病毒药物，反式包装，缺陷型病毒IIAbstractABSTRACTZika