肠炎沙门氏菌ssrab、hila、hild基因缺失菌株的构建及其生物学特性研究

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1、10364AnhuiAgriculturalUniversityDissertationfortheMasterateConstructofssrAB,hilA,hilD-deficientinSalmonellaEnteritidisandCharacteristicofMutantsCandidate:CaoKunSupervisor:Prof.LiYuAcademicDegreeappliedfor:MasterofAgricultureSpeciality:PreventiveVeterinaryMedicineResearc

2、hfield:InfectiousdiseasesofdomesticanimalsCollege:AnimalTechnologyschoolofAnhuiAgriculturalUniversityJune,2015独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加Ｗ标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明。与我

3、确的说明并表示了谢意。研究生签名：普追时间：年月化日关于论文使用授权的说明本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即；学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，光许论文被查阅和借阅，可Ｗ采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可Ｗ用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。（保密的学位论文在解密后应遵守此协议）研究生签名：營髮时闻：如月Ｐ日ｆｉｒ年＾／？一第导师签名：时间；年＾月Ｗ日摘要沙门氏菌（Salmonella）能引起人和动物多种不同

4、临床表现的沙门氏菌病，并为人类食物中毒的主要病原之一，对医学、兽医和公共卫生均十分重要。与沙门氏菌致病性相关的基因成簇地分布在基因组上，形成一个个相对独立的单位，称为沙门氏菌毒力岛（SalmonellapathogenicityIsland,SPI）。在沙门氏菌毒力岛中，毒力岛1（SPI1）和毒力岛2（SPI2）分别在沙门氏菌侵袭和定殖过程中扮演了重要的角色。研究表明，ssrAB基因调节了沙门氏菌SPI2的表达，hilA基因促进沙门氏菌SPI1的表达，hilD基因则通过对ssrAB基因和hilA基因的调节，实现调控沙门氏菌SPI1和S

5、PI2的作用。然而，ssrAB、hilA、hilD对沙门氏菌致病性作用的研究尚未见报道，ssrAB、hilA、hilD基因缺失菌株的毒力变化也尚不清楚。本研究以肠炎沙门氏菌为研究对象，通过同源重组技术，分别构建ssrAB、hilA、hilD单基因、双基因以及三基因缺失菌株，即ΔssrAB、ΔhilA、ΔhilD、ΔssrABhilA、ΔssrABhilD、ΔhilAhilD、ΔssrABhilAhilD，并将缺失菌株的生长速率、生物膜形成能力、对小鼠的致病性、在小鼠体内的定殖能力、对细胞的粘附性以及刺激机体产生相应细胞因子水平等生物学

6、特性与亲本菌株进行比较。结果显示，缺失菌株的生长速率与亲本菌株无显著差异；除ΔhilD外，其余缺失菌株的生物膜形成能力与亲本菌株之间差异不显著，ΔssrABhilAhilD的生物膜形成能力则显著低于其他缺失菌株和亲本菌株；ΔssrAB、ΔhilA、ΔhilD对小鼠的半数致死量（LD50）显著高于亲本菌株，ΔssrABhilAhilD的LD50在所有构建的缺失菌株中是最高的；所有缺失菌株对小鼠十二指肠的组织损伤程度均明显低于亲本菌株；ΔhilA对HeLa细胞的黏附力显著低于亲本菌株、ΔssrAB以及ΔhilD（P<0.05），ΔssrA

7、BhilA、ΔssrABhilD、ΔhilAhilD以及ΔssrABhilAhilD的黏附力无显著差异（P>0.05），而ΔssrAB的定殖率在所有基因缺失菌株和亲本菌株中最低（P<0.05）；7个缺失菌株刺激机体产生IL-1、IL-18、IFN-γ的能力与亲本菌株无显著差异（P>0.05）。结果表明，本研究通过基因工程技术成功构建了ssrAB、hilA、hilD单基因、双基因以及三基因缺失菌株；所构建的缺失菌株致病力较亲本菌株低，且具有与亲本菌株相似的生长速率，能够刺激机体产生相应的细胞因子，可以作为沙门氏菌减毒活疫苗或活载体的候选

8、菌株。关键词：肠炎沙门氏菌；ssrAB、hilA、hilD基因；缺失菌株；构建；生物学特性IIAbstractSalmonellaisanimportantpathogenthatcausesSalmonellosisi