应用不同分型方法对布鲁氏菌临床分离株基因分型的研究

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1、分类巧Ｓ８４１３６３２３５．４＋４学号Ｓ２０四川巧处大学专化硕ｄｔｒ学位论文应用不同分型方法对布鲁氏菌临巧分离蛛基因分型的研究庄抒冰％？？、指导教师彭广能教授校外导师膝泽良研究员）（军事医学科学院学位类别兽医硕±领域名称临巧兽医学研巧方向临床分子诊断与应用＾４－＊．％‘：‘？２０１５年５月＿：＇’諫．＊？？？？，ＶＳｉｃｈｕａｎＡｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｇｙＭａｓｔｅｒＤｅｒｅｅ

2、Ｔｈｅｓｉｓｇ＇Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｅｎｏｔｉｎｆｏｒ公７？ｃｃ／／ａｃｌｉｎｉｃａｌｇｙｐｇｉｓｏｌａｔ：ｅｓｕｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｎｍｅｔｈｏｄｓｇｙｐｇＢｙＺｈｕａｎｇＹｕｂｉｎｇＤｉｒｅｃ化ｄｂＰｒｏｆ．ＰｅｎＧｕａｎｎｅｎｙｇｇｇＲｅｓｅａｒｃｈｄｉｒｅｃｔｉｏｎＭａｓｔｅｒｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒＭｅｄ：ｙｉｃｉｎｅＭａ２０巧ｙ论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研巧工作所取得的成果。尽我所知，除

3、了文中特别加注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个！＾标人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机一构的学位或证书所使用过的材料。与我同工作的同志对本研巧所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研巧生签名：《年＾月曰ｉ关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留，；学校有权保留并向国家有、使用学位论文的规定即关部口或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可ｙ、采用影印、缩印或扫描等复制手段保存＞、、汇编学位论文。同意四川农业大

4、学可１＾１用不同方式在不同媒体上发表传播学位论文的全部或部分内容。□本论文不保密。□本论文保密，在解密后适用本授权。＿＿年□内划＂＂（请在Ｗ上Ｖ）＂研究生签名；〇年＾々八１＾月／若曰导师签名：年月曰如作重少／／文摘要布鲁巧菌病（Ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ）是由布鲁氏菌航０属的细菌侵入机体引起一的类全球性分布的传染－变态反应性人畜共患传染病。该病不仅会给畜牧业带。来重大的经济损失，还严重危害人类健康依据对宿主偏好性、培养特性Ｗ及生物学特性的不同，将布鲁氏菌分为６个经典的种，分别为牛种、羊种、

5、猪种、犬种、绵羊附睾种和沙林鼠种，其中牛种和羊种是最为常见的人布病的病原体。目前布鲁氏菌的分型方法主要有表型分型和基因分型，其中基因分型方法在布鲁巧菌快速种型鉴定，病原的溯源分析Ｗ及菌株之间的差异与联系等方面起到一。了重要作用本研究旨在寻找种快速、分辨率高的分型方法，对布鲁民菌临床分离株进行基因分型，分析菌株的遗传多态性，建立菌株之间的系统发育关系，为我国布鲁氏茵病的分子流行病学和病原溯源研究提供依据。本研究通过收集临床分离的２３株布鲁氏菌，综合运用１６ＳｒＤＮＡ、ＡＭＯＳ－ＰＣＲ、改良后的多位

6、点序列分型ＭｕｌｔｉｐｌｅｌｏｃｕｓｓｅｑｕｅｎｃｅｔｉｎＭＬＳＴ｜ｙ＞（ｙｐｇ，）：及多位点可变数目串联重复序列分析（Ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓｖａｒｉａｂｌｅｎｕｍｂｅｒｔａｎｄｅｍｒｅｐｅａｔａｎａｌｙｓｉｓ，ＭＬＶＡ）等技术，对布鲁氏茜进行基因分型，分析各方法的特点并探讨临床分离株的遗传进化关系。２３株布鲁氏菌分离株的１化ｒＤＮＡ序列经ＢＬＡＳＴ比对后，结果显示与布鲁；上。核酸序列相似性达到了９９氏菌的同源性最高９％．８５％，达到了９１＾１，但不能－ＰＣ民对２３株区分种、型。采用ＡＭＯ

7、Ｓ布鲁氏菌分离株进行种型鉴定，其中２２株为羊种１、２或３型。１株为牛种１、２或４型。为了提高ＭＬＳＴ方法的分析效率，本研究通过重新巧计引物，加长扩增产物长度，使扩增产物的长度在巧Ｏｂｐ左右，建立了改良型ＭＬＳＴ方法（ＥＭＬＳＴ）。传统ＭＬＳＴ方法（ＣＭＬＳＴ）九个基因的有效序列长度在４２２ｂｐ至５８９ｂｐ之间，而改良型ＭＬＳＴ方法的有效序列长度在６１１ｂｐ至７５９ｂｐ之间，改良型ＭＬＳＴ方２１ｂ－３０２ｂ法每个基因参与分型的有效序列长度增加了１ｐｐ，增加的比例在２４的％－７１．．５６％么间。对２３株

8、布鲁氏菌进行了０的１＾８了和６＾化８了的分析〇］＾化３１，方法定义了５个ＳＴ型，ＥＭＬＳＴ方法定义了１０个ＳＴ型。九个基因中，挪：、ｇｙｒ公和基因増加了１个基因型。多态性位点的数量与该基因型别的多少成正１比，通过加长每个基因的扩增序列，４个