牛结合珠蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

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1、Universitycode：10223Classifiedcode：S854Graduatenumber：XS1233086Confidentialdegree：PublicHeilongjiangBayiAgriculturalUniversityMasterDissertationPreparationandPreliminaryApplicationofMonoclonalAntibodiesAgainstBovineHaptoglobinPostgraduate：WangCai-hongSupervisor：Associ.Prof.S

2、unDong-boMajor：ClinicalveterinarymedicineResearchdirection：VeterinaryclinicalmicrobiologyCollegeofAnimalScienceCollege：andVeterinaryMedicineDaqingChinaJune,2015摘要在奶牛疾病中，亚临床炎性疾病因临床症状不明显，早期不易被发现，给奶牛养殖业带来严重的经济损失，已经成为制约奶牛养殖业健康发展的一个瓶颈问题。因此，奶牛亚临床炎性疾病早期预警方法的研究具有重要科学意义及应用价值。牛结合珠蛋白（b

3、ovinehaptoglobin，BoHp）是一种血浆急相蛋白，是多种奶牛感染性疾病的生物标记物，在炎性疾病早期诊断中有潜在的应用价值。在本研究中，以纯化的pirBoHp重组蛋白作为抗原，免疫BALB/c小鼠，利用淋巴细胞杂交瘤技术，制备了5株BoHp单克隆抗体，分别命名为1B3、6D6、6D3、6B7和1C1。Westernblot结果显示，在制备的5株BoHp单克隆抗体中，1B3、6D6、6D3和6B7能识别牛血浆中天然BoHp的α链。进一步抗体亚型鉴定结果表明，1B3、6D6、6D3和6B7抗体亚型均为IgG1，轻链型为kappa链。利用

4、亲和层析技术对BoHp单克隆抗体1B3、6D6、6D3和6B7腹水中的IgG蛋白进行了纯化，进一步利用改良过碘酸钠标记法，对纯化的4株BoHp单克隆抗体进行辣根过氧化物酶（HRP）标记，利用纯化的BoHp单克隆抗体和HRP标记抗体，建立BoHp的定量ELISA检测方法。敏感性试验结果显示，BoHp定量ELISA最低检测浓度为31.25ng/mL。临床样品检测结果显示，本研究建立的pirBoHp定量夹心ELISA方法与商品化ELISA符合率为75%。利用柠檬酸三钠还原法，制备胶体金颗粒，并对BoHp单克隆抗体进行金标记，进一步利用纯化的BoHp单

5、克隆抗体和羊抗鼠IgG印迹硝酸纤维素膜分别作为检测线和质控线，组装成检测BoHp的胶体金试纸条。条件优化试验结果显示，BoHp单克隆抗体1B3作为金标抗体，6D3作为检测抗体时，胶体金试纸条的检测效果最佳。敏感性试验结果显示，组装的BoHp胶体金试纸条最低检测浓度为0.45μg/mL。临床试验结果显示，48份不同跛行程度奶牛血清样品中43份样品出现信号，其中14份样品出现强信号，其阳性率为89.58%。表明胶体金试纸条能特异性识别牛血清中BoHp。本研究拟通过已筛选的奶牛亚临床炎性疾病预警Marker-牛结合珠蛋白（BoHp）作为研究靶标，制备

6、BoHp蛋白的单克隆抗体，建立奶牛炎性疾病预警MarkerBoHp的诊断方法，通过临床效果评价，明确BoHp作为奶牛亚临床炎性疾病预警Marker的可行性，为奶牛亚临床炎性疾病的早期预警及治疗提供有效工具。关键词：奶牛，炎性疾病，BoHp，单克隆抗体，定量ELISA，胶体金试纸条IAbstractInmanydiseasesofdairycows,thesubclinicalinflammatorydiseasehasbecomeabottleneckwhichrestrictsthehealthydevelopmentofthedairyfa

7、rmingalot,duetoitsclinicalsymptomisnotsoobviousthatitisnoteasytobefoundintheearlystage,thusbringingtheseriouseconomiclossestothedairyfarming.Asaresult,theresearchaboutearlywarningmethodofthesubclinicalinflammatorydiseaseofdairycowshasveryimportantscientificsignificanceandapp

8、licationvalue.Bovinehaptoglobin(BoHp)isakindofurgentphaseplasmaprotein,whic