无选择标记抗晚疫病转基因马铃薯的获得

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1、分类号：Q37密级：公开UDC：学校代码：10127硕士学位论文论文题目：无选择标记抗晚疫病转基因马铃薯的获得英文题目：ObtainingofMarker-freeTransgenicPotatoResistanttoLateBlight学位类别：理学硕士研究生姓名：肖欢欢学号：201202213学科(领域)名称：遗传学指导教师：辛翠花职称：副教授协助指导教师：郭江波职称：教授2015年6月6日内蒙古科技大学硕士学位论文摘要马铃薯是全球第三大重要农作物，仅次于小麦和玉米。由致病疫霉菌（Phytophthorainfestans）引起的晚疫病，是导致马铃薯减

2、产最严重的病害之一，在世界上绝大多数马铃薯的栽培地区广泛传播。采用传统育种、化学农药等方法来防治马铃薯晚疫病虽然早有研究，但至今收效甚微。转基因技术的兴起为晚疫病的防治提供了新的锲机。本实验采用生物安全的转基因方法，将抗晚疫病基因R1、RB、R3a转化马铃薯栽培品种Desiree，获得生物安全的抗晚疫病转基因马铃薯。研究内容如下：1)无标记载体pMF-LIC构建。以引物OXN037/OXN038对质粒pJG100进行PCR扩增，获得LIC序列的片段，胶回收后与质粒pMF-GUS分别进行XbaⅠ/SacⅠ双酶切，回收片段用T4DNA连接酶连接，热激法转化大肠

3、杆菌DB3.1，经菌落PCR、质粒PCR和质粒XbaⅠ/SacⅠ双酶切及SacⅠ单酶切鉴定，成功构建了无标记植物表达载体pMF-LIC。2)抗晚疫病基因克隆到无标记载体上。分别用引物OXN045/OXN046、OXN051/OXN052、0XN093/OXN096从质粒pBINPLUS-R3a、pCLD04541-R1、pCLD04541-RB上PCR扩增出抗晚疫病基因R3a、R1、RB，同时用ApaI酶切载体pMF-LIC。用不依赖于连接反应的克隆（LIC）方法将抗晚疫病基因R3a、R1、RB分别克隆到无标记植物表达载体pMF-LIC上，热激法转化大肠杆

4、菌TOP10，经菌落PCR、质粒PCR、质粒XbaⅠ/SacⅠ双酶切及SacⅠ单酶切验证重组载体pMF-R1/RB/R3a构建成功。3)抗晚疫病基因工程农杆菌获得。通过三亲融合，在帮助菌HB101的帮助下将重组载体pMF-R1/RB/R3a转入农杆菌AGL0中，经过菌落PCR、质粒PCR、质粒XbaⅠ/SacⅠ双酶切及SacⅠ单酶切鉴定，成功构建工程农杆菌AGL0-pMF-R1/RB/R3a。4)无选择标记抗晚疫病转基因马铃薯的获得。克隆的抗晚疫病基因R1、RB、R3a通过农杆菌介导的遗传转化方法分别转入马铃薯栽培品种Desiree中，经PCR初步检测出抗

5、晚疫病转基因马铃薯植株。现已获得4株转R3a的阳性转基因马铃薯植株，R1和RB的转基因马铃薯植株正在进一步验证中。II内蒙古科技大学硕士学位论文本实验获得的转基因马铃薯植株，为后续田间构建马铃薯抗晚疫病近等混合系提供了基础，为马铃薯晚疫病的持久防治提供了理论和实践基础。关键词：马铃薯；晚疫病；无标记；转基因III内蒙古科技大学硕士学位论文AbstractPotatoistheworld’sthirdmostimportantfoodcrop,afterthewheatandrice.PotatolateblightcausedbyPhytophthorai

6、nfestansisoneofthemostseriousdiseasestodecreasethepotatoproduction,whichspreadwidelyinthevastmajorityofpotatocultivationareaintheworld.P.infestansisstilldifficulttocontrolbygeneticbreedingandchemicalmethodstoday.Transgenictechnologyprovidesanewchanceforthecontrolofthepotatocultica

7、tion.Inthisresearch,R1,RBandR3awereseparatelytransferredintopotatocv.Desireebymarker-freetransgenicassay,andtheaimofthisresearchistoobtaintransgenicpotatoeswithbiologicalsafety.Themainresultsweredisplayedasfollows:1)Constructionofmarker-freevectorpMF-LIC.LICfragmentofplasmidpJG100

8、amplifiedbyPCRwithprimersOXN037/O