中药质量生物控制模式和方法的研究

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1、中药质量生物控制模式和方法的研究——板蓝根抗病毒效价检测方法的建立李寒冰1，2，肖小河1*，鄢丹1，魏丽1，2，罗云1，2（1．解放军第三0二医院/全军中药研究所，北京100039；2．成都中医药大学药学院，四川成都610075）[摘要]目的：考察板蓝根体外抑制流感病毒神经氨酸酶（NA）的活性，在此基础上建立板蓝根抗病毒生物效价检测方法，用于板蓝根质量生物控制。方法：采用荧光分光光度法检测板蓝根抑制NA的活性，优化检测条件，以对比检定概率单位（4·4）法设计试验，测定板蓝根抗病毒效价。结果：板蓝根有明显

2、体外抑制NA的，量效曲线与阳性对照药达菲相同。反应率经概率单位转换后，剂量（D）对数与反应函数（Y）呈良好的直线关系（Y＝8.73+1.22×Log(D)，R=1），重复性考察RSD=5.78%，表明该反应线性好，测量精密度高。对10个批次板蓝根药材的抗病毒效价进行实际测定，结果均通过可靠性检验，表明本方法测定结果可靠。结论：板蓝根具有体外抑制流感病毒神经氨酸酶活性，经方法优化及实际检测，所建立的生物效价检测方法可以作为板蓝根质量生物控制方法。[关键词]板蓝根；抗病毒活性检测；神经氨酸酶；生物效价现行中

3、药质量控制模式基本上是参照化学药的模式，以指标性成分的定性定量鉴别为主。然而中药化学成分十分复杂，多数中药药效物质并不清楚，指标性成分往往不是主要有效成分，其含量多少与临床疗效关联不大甚至无关联。这种“惟成分论”的质控模式难以客观有效地评价中药质量，也难以体现中药防病治病的本质和特点。为寻求解决中药质量控制问题的新突破笔者所在课题组领衔肖小河研究员首次提出：建立中药质量生物控制模式和方法，从常规、化学和生物活性多重角度共同把关中药质量，创新和完善中药质量控制方法体系[1]。《中国药典》2010年版编制大

4、纲业已指出：“中药质量标准要逐步由单一指标性成分定性定量测定向活性有效成分及生物测定的综合检测过渡”[2]。可见将生物活性测定法引入到中药质量控制和品质评价中来，是中药质量控制模式和方法研究的重要发展方向。然而，质量控制不同于药效研究，所用方法除了要求疗效相关外，更应满足定性/定量准确、灵敏快捷、简单、重现性好等基本要求。因而优选和建立适宜的生物活性检测方法是中药质量生物控制模式的关键点和难点。板蓝根（RADIXISATIDIS）是常用中药，临床应用广泛、在用于防治流感等病毒性疾病时往往取得较好临床效果

5、，其抗流感病毒的药理研究也多见报道[3-6]，抗流感病毒作用是板蓝根的主要功效之一。流感病毒神经氨酸酶（NA）活性体外检测的方法已成为国内外抗流感药（包括植物药）的重要筛选方法之一[7]。该方法以检测药物对NA活性的影响来表征其抗流感病毒活性的强弱，具有客观、灵敏、快捷、稳定、重现性好等特点。研究表明：板蓝根具有体外抑制NA的生物活性，IC50约0.90μg（生药）·L-1，7其活性强度随品质差异而呈现差异性。本文按照生物检定的要求设计检测方法，通过对比检定，结果可对板蓝根的质量和品质进行评价，有关研究

6、结果如下。1仪器与材料1.1药材及试剂板蓝根药材，经解放军中药研究所肖小河研究员鉴定均为来源于十字花科（Cruciferae）植物菘蓝IsatisindigoticaFort.的干燥根。达菲胶囊(OseltamivirphosphateCapsules)，批号：B1212，Rochepharma(Schweiz)。工作对照品：板蓝根对照药材（中国药品生物制品检定所）制成醇提取物（得率7.70%）。NA底物：4-methylumbelliferyl-N-acetyl-α-D-neuraminicacid(

7、MUNANA，Sigma)。1.2主要仪器FLUOstarOPTIMA荧光酶标检测仪，德国BMG公司；Ⅱ型生物安全柜，NUAIRE产品；96孔荧光酶标板，美国COSTAR公司。1.3细胞系、病毒株及NAMDCK细胞、流感病毒（A/PR8/34）：军事医学科学院微生物传染病研究所冻存。NA的制备：参照文献方法[8,9]，进行MDCK细胞传代培养并接种病毒，待细胞完全被感染病变后取滤除细胞的病毒液，灭活，0.22μm滤器滤过后分装，作为NA的原酶液，-70℃冻存。1.4NA体外荧光检测原理化合物MUNANA

8、是NA的特异性底物，在NA作用下的产物4M（7-Hydroxy-4-methylcoumarin，C10H8O3）在355nm入射波长激发下，可以产生460nm荧光，采用荧光检测器测定该波长荧光强度（FluorescenceIntensity）的变化，可以灵敏地反应NA活性[10]；同样，如反应体系中加入抑制NA活性的药物，则荧光强度会相应减弱，从而该药物的NA抑制活性就能通过荧光强度的变化被表征。（图1）7Fig.1Schematicdi