核酸恒温扩增技术检测结核分枝杆菌的比较研究

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1、分类号：密级：学号：2012108021单位代码：10759石河子大学硕士学位论文核酸恒温扩增技术检测结核分枝杆菌的比较研究学位申请人王慧党陈创夫教授指导教师曹旭东副教授申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称预防兽医学研究方向畜禽病原分子生物学所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2015年6月TheComparativeResearchofNucleicAcidThermostaticExpansionTechnologytoDetectMycobacteriumTuberculosisADissertationSubmittedtoShihe

2、ziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsFortheDegreeofMasterofAgricultureByWangHui-Dang(PreventiveVeterinary)DissertationSupervisor:Prof.ChenChuang-FuJune,2015Shihezi,Xinjiang,China石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论

3、文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。课题来源国家科技重大专项项目项目名称：新疆结核分枝杆菌耐药性以及结核病潜伏感染者的快速鉴别诊断技术研究项目编号：2013ZX10

4、003003-002摘要结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)引起的一种人畜共患传染病，结核分枝杆菌是人和动物结核病的主要病原。人结核病和动物结核病是可以相互传染的，人类的结核病可以通过呼吸或飞沫传给人或其他动物，动物结核病除了通过呼吸或飞沫外，还可以通过一些动物产品如肉、奶、蛋等畜产品进行传播。目前，最为常见的动物结核就是牛结核病，它不仅给畜牧业带来严重的影响，并且给人类的健康安全也造成了很大的威胁。近年来，人结核病的发病率明显上升，特别是儿童肠结核的发病率明显增加，有报道显示，从这些儿童患者中分离

5、的30%的菌株为牛分枝杆菌。结核病的实验室诊断是发现传染源的主要途径和手段，同时也是确定结核病诊断、切断传播途径并制定治疗方案的重要依据。由于传统的检测方法不够完善，如检测时间长、灵敏性与特异性不高、对设备要求高等。因此，建立快速、准确、灵敏、价格低廉的结核病实验室诊断方法对结核病控制有着极为重要的意义。目的：建立一种快速、准确、价格低廉易于临床推广的，并可以运用于畜产品中结核分枝杆菌检测的方法。方法：通过优化环介导等温扩增检测技术(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)与RNA恒温扩增实时检测技术(

6、Simultaneousamplificationandtesting，SAT)的反应条件与体系，建立起两种可以用于牛乳中结核分枝杆菌检测的核酸扩增方法。本实验通过对牛奶中结核分枝杆菌的DNA和RNA的提取方法以及对每种方法的反应体系、反应温度、反应时间进行优化，并对牛乳中结核分枝杆菌检测的灵敏度、特异性、重复性进行检测，确定这两种方法对牛乳中结核分枝杆菌的最低检测浓度（灵敏度）。同时还将环介导等温扩增技术与RNA恒温扩增实时检测技术同结核罗氏培养技术、抗酸染色镜检、PCR技术进行比较，评价与分析各种检测方法对牛乳中结核分枝杆菌的检测结果，以确定

7、最佳检测方法，为临床应用提供参考依据。结果：环介导等温扩增技术和RNA恒温扩增实时检测技术的灵敏度、特异性、重复性都比较高，对牛乳中结核分枝杆菌的最低检测浓度分别为3×101CFU/mL和3×100CFU/mL。RNA恒温扩增实时检测技术的灵敏度要明显高于环介导恒温扩增技术，并且是它的10倍。牛乳中结核分枝杆菌的DNA与RNA的提取方法分别为改良后的CTAB/NACL法与改良后的手工提取RNA法。结核培养技术、抗酸镜检、PCR技术对牛乳中结核分枝杆菌的检测的最低浓度分别为3×105CFU/mL、3×108CFU/mL、3×104CFU/mL。结论

8、：建立的环介导等温扩增技术与RNA恒温扩增实时检测技术可用于牛乳中结核分枝杆菌的检测，这两种方法操作简单，对实验仪器要求不高，易于在产品