泛素化和苏素化修饰对α-突触核蛋白降解的影响

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1、单位代码１０４７５学号１０４７５３１２０９６６分类号Ｑ１８９皆為乂聲硕ｉ学位论文泛素化和苏素化修饰对ａ－突触核蛋白蜂解的影响学科、专业：神经生物学研究方向：神经退行性疾病基础研究申请学位类别：理学硕±申请人：位南南指导教师：魏建设教授二〇－五年五月＞■■Ｊ‘－谦■．＼，－？－ｒ．．，．．［：一，．．，－．’关于学位论文独创声明和学术诚信承诺本人向河南大学提出硕壬学位申请。本人部重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指字下独立完成的，对所研究的课题有

2、新的见解。据我所知，徐文中特別加Ｗ说明、标注和致谢的地方外论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果也不包括其，，他人为获得任何教育一、科研机构的学位或证书而使用过的材料。与我同工作的同事对本研究所傲的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。在此本人碟重承诺：所呈交的学位论文不存在舞弊作伪行为文责自巧。，学位申请人（学位论文作者）签名：化雨清２０１年ｙ月曰／Ｓ＾关于学位论文著作权使用授权书本人经河南大学审核批准授予硕壬学位。作为学位论文的作者，本人完全了解并同机意河南大学有关保留、使巧学位论丈的要求，巧河南大学有权向国家图书馆、科研

3、信忠构、数据收集机构和本校图书馆等提供学位论文（紙质文本和电子文本）Ｗ供公众检索、查阅。本人授权河南大学出于室扬、展览学校学术发展和进巧学术交流等目的，可Ｗ采取影印、縮印、担描和拷贝等复制手段保存、汇編学位论文（纸质文本和电子文本）。（涉及保密内容的学位论文在解密启适用本搜权书）学位获得者（学位论文作者）签名：也蘭商２０１女年支月ｆ《曰学位论文指导教师签名：一２〇ｉｉｙ年ｙ月ｆ《曰THEEFFECTOFUBIQUITINATIONANDSUMOYLATIONMODIFICATIONONα-SYNUCLEINDEGRADATIONADisserta

4、tionSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceByNannanWeiSupervisor:Prof.JiansheWeiDate:May,2015摘要α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)是一种包含有140个氨基酸的小分子酸性蛋白质。α-Syn普遍存在于脑部神经元内。α-Syn基因的缺失或突变，会引起多种神经疾病，特别是诱发常染色体显性遗传性帕金森病。然而，α-Syn突变体诱发帕金森病的确

5、切机制在很大程上仍未有明确定论。蛋白质翻译后修饰与神经退行性疾病的关系是近年来的研究热点，尤其是对蛋白质的苏素化(SUMOylation)、泛素化(Ubiquitination)以及磷酸化(phosphorylation)的研究。但α-Syn的苏素化、泛素化与α-Syn降解过程的研究报道较少。因此，这项研究中，我们主要探讨苏素(Smallubiquitin-relatedmodifierprotein,SUMO)和泛素(Ubiquitin)在α-Syn降解途径中的作用，揭示SUMO和Ubiquitin对α-Syn的降解通路转换的影响。研究结果将丰富帕金森病发病过程中蛋白质降解的机理。本

6、实验首先用两步法PCR技术构建带有Flag标签的野生型和突变型Ubiquitin真核表达质粒，即Flag-UbiquitinWT、K29A、K48A、K63A以及双突变型G75AG76A。通过双酶切和基因测序确定序列的正确性；通过WesternBlot方法确定重组质粒在细胞上的表达；通过免疫荧光标记技术了解野生型和突变型Flag-Ubiquitin在细胞内分布特征；通过LDH和WST-1的检测分析野生型和突变型Flag-Ubiquitin的细胞毒性。发现野生型和突变型Flag-Ubiquitin多分布于细胞胞浆，但在细胞核内也有少量分布。突变型Flag-Ubiquitin均有不同程度

7、的细胞毒性，其中Flag-UbiquitinG75AG76A的毒性最大。其次，B103细胞分别瞬时转染α-SynWT和A53T质粒，然后用浓度为200μg/mL的HygromycinB建立具有抗性筛选的稳定表达α-SynWT、A53T的两种B103细胞株。最后，在稳定表达α-SynWT和A53T的B103细胞株上，分别瞬时转染重组质粒Flag-Ubiquitin，通过免疫荧光标记分别检测α-Syn与SUMO、Ubiquitin以及与26S蛋白酶体定位结合情